正家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是家蚕微粒子病的病原,因具有水平传播与经卵(胚胎)传染的特点而被世界各养蚕国家和地区列为蚕种生产的唯一检疫对象。自1857年发现该病原后,世界各地又陆续从家蚕体内分离出多种不同种属的微孢子虫。目前被发现或报道的微孢子虫已有150多个属,1400多个种,而在各地蚕区的蚕种生产中相继发现了40多种(株)微孢子虫。这些形态多样的病原微孢子虫的存在给家蚕微粒子病的防治带来了困难。微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。不同种属的微孢子虫基因组大小差异悬殊,基因结构复杂,且一些基因与真菌的同源序列高度相似,因而引起昆虫病理学家和进化生物学家的关注。本课题组在国家蚕桑产业技术体系亚热带蚕病防控岗位专家项目经费的资助下,用了将近3年的时间,采用RNA-Seq测序技术对家蚕微孢子虫(广东株)转录组进行了测序和生物信息学分析。采用oligod T富集在3’端具有ploy A结构的mRNA的方法,分别构建了2个家蚕微孢子虫转录组测序文库,进而利用Hiseq2000测序仪进行高通量测序,测序策略为双端测序长度100 bp,共测得7.597 Gb双末端数据。家蚕微孢子虫RNA提取后极易降解,经过多次试验调整,建立了有效的家蚕微孢子虫RNA的提取方法。数据分析显示家蚕微孢子虫转录组的GC含量约为30%,与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)及按蚊微孢子虫(Anncali-ia algerae)相近,但比修氏脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)的GC含量(47.30%)低。针对家蚕微孢子虫转录组的GC含量低和存在较多低复杂度序列的特点以及已发表的微孢子虫基因组数据分析结果,本课题组开发了基因序列组装软件MGAT(Microsporidia Gene Assemble Tool,正在申报软件著作权),对已测序的7.597 Gb数据进行分析,共获得了2903条基因序列,比用Trinity软件组装的结果(2734条基因序列)多169条。应用MGAT软件进行分析还减少了较多的不完整基因片段。BLASTN比对显示,通过转录组测序获得的预测基因与NCBI上已报道的家蚕微孢子虫基因序列相似度极高(均在95%以上)。采用RSEMv1.1.19软件分析已组装的基因的表达水平,大部分基因的表达水平(FPKM值)在100以下,但有趣的是孢壁蛋白基因的表达水平相当高,同时ATP/ADP转位酶基因也有显著的表达。用BLASTP将组装的基因与NCBI中的nr数据库进行比对分析和注释,共有1414个基因被注释,其余的1489条序列未被注释,预计还有200条基因序列未能组装成功。从预测的基因中选择孢壁蛋白(HWSP)基因、极丝蛋白(PTP)基因、α和β微管蛋白基因、热激蛋白(HSP)基因和核糖体RNA等进行PCR扩增及测序验证,测序结果与预测基因序列的一致性均达到98%以上。预测基因中发现了127条序列与已报道的128条家蚕微孢子虫细胞质核糖体蛋白基因序列存在高度的同源性,92.1%的基因序列相似度大于95%,其中43条序列相似度达100%。同时,获得了与家蚕微孢子虫侵染有关的极丝蛋白基因PTP1、PTP2和PTP3的部分或完整序列,其中PTP2除完整的编码区序列外,还发现该基因的5’端非翻译区和3’端非翻译区,这将为研究家蚕微孢子虫侵染的分子机制提供参考信息。