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纤维素酶是一个水解纤维素的复杂酶系,主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,在饲料、食品、纺织和生物能源等领域具有巨大的市场潜力.在纤维素酶的工业化生产过程中,纤维素酶活力水平及成本问题是制约其实际应用的一个重要因素.
本文对里氏木霉T306进行传统诱变及全基因组重排育种,并对选育获得的纤维素酶高产菌株进行5L罐发酵工艺条件研究,研究结果如下:
1、优化了高产纤维素酶突变菌株的筛选培养基,确定初筛培养基中添加0.1％(w/v)乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选;摇瓶培养基碳、氮源及添加量(w/v)为:乳糖1.50％,硫酸铵0.14％,尿素0.05％,蛋白胨0.10％,初始pH自然,添加0.6％(v/v)吐温-80有利于产酶;最适发酵条件为:发酵7d,装液量30mL/150mL,转速180r/min,接种量50μL/30mL.通过紫外和微波诱变，筛选获得6株酶活力较高的突变菌株0409,0505,0506,0516,W0103和W0608。
2、里氏木霉原生质体制备和再生的最佳条件为:3.5%溶壁酶，菌丝菌龄22h,酶解时间4h,酶解温度30℃，采用pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，以高渗筛选培养基为再生培养基，再生培养基中渗透压稳定剂为0.8mol/L NaCl。在此条件下，里氏木霉原生质体量可达1.44×107个/mL，再生率为2.64%.
3、对里氏木霉原生质体的融合条件进行了研究，最佳融合条件为:将紫外照射90s或微波辐射200s两种方式灭活后的原生质体混合，在30%PEG,30mmol/LCa2+、30℃条件下处理12min，原生质体融合率可达0.5%。以突变菌株0409,0516,W0103和W0608为亲本菌株进行两轮基因组重排实验后，获得一株遗传稳定、产酶能力较强的融合子G2-0832，其CMC酶活力达86.40U/mL，较出发菌株提高了57.08%。融合子G2-0832的胞外蛋白表达量与出发菌株相比明显增强了。
4、对里氏木霉进行 5L发酵罐实验，初步确定适宜的纤维素酶发酵工艺为:发酵培养基主要氮源为玉米浆干粉;补料速率不宜太快，培养24-40h，补料速率控制在12mL/h左右，40h后为18mL/h左右;接种量10%;初始搅拌速度400r/min。在此条件下，出发菌株和融合子G2-0832的CMC酶发酵水平分别可达450U/mL及600U/mL,G2-0832产酶能力比出发菌株提高约30%.