水稻类囊体膜蛋白质复合物的BN/SDS-PAGE分离与蛋白质组学研究

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常规的2D IEF/SDS-PAGE 分离方法结合质谱鉴定技术,已广泛应用于植物蛋白质组学研究领域,然而 IEF/SDS-PAGE 无法展现植物细胞中广泛分布的疏水性膜蛋白质及蛋白质复合物(如细胞质膜、线粒体膜、质体膜、叶绿体被膜及类囊体膜中的蛋白质复合物等)。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:(Blue Native-PAGE)方法,由于引入非离子去垢剂十二烷基麦芽糖苷(DM),洋地黄皂苷、曲拉通 X-100等作为膜蛋白质复合物的溶剂,在 pH 接近生理中性条件下电泳分离膜蛋白复合物,保持了其天然结构和生物活性,能在第一向 BN 胶上获得生物膜蛋白复合物的组成及分子量大小等信息,被第一向 BN-PAGE 分离的膜蛋白复合物经变性处理,再进行第二向 SDS-PAGE 分离(即2D BN/SDS—PAGE),能直观显示组成膜蛋白复合物的各蛋白亚基,结合生物质谱技术,可鉴定各亚基成分,现已经用于亚细胞器水平的蛋白质组学研究。本研究以水稻(Oryza Sativa)品种93-11灌浆期叶片为材料,通过蔗糖密度梯度离心制备类囊体,采用 BN-PAGE 分离,获得与光合作用相关的膜蛋白复合物有:①光系统Ⅰ反应中心复合物和捕光色素复合物Ⅰ(PSI+LHCI),分子量约为568 kDa;②ATP 合成酶 (F1FO-ATPase),分子量约为548 kDa;③光系统Ⅰ反应中心复合物(PSIcore)。分子量约为379 kDa:④ATP 合成酶 F1(F1-ATPase),分子量约为327 kDa;⑤光系统Ⅱ反应中心复合物(PSI),分子量约为309 kDa;⑥细胞色素 b6f 复合物(Cytb6f),分子量约为309 kDa;⑦缺乏 CP43的光系统Ⅱ反应中心复合物(PSI-CP43),分子量约为231 kDa;⑧捕光色素复合物Ⅱ(三聚体)(LHCI(3)),分子量约为165 kDa;⑨捕光色素复合物Ⅱ(二聚体)(LHCI(2)),分子量约为134 kDa;⑩捕光色素复合物Ⅱ(单聚体)(UHCI(1)), 分子量约为108 kDa。经过第二向 SDS-PAGE 对各复合物的组成亚基分离之后,再经 MALDI-TOF-WS 鉴定,已确认与上述①-⑩复合物对应的蛋白质亚基(基因)为:①PSI+LHCI: psaA、psaB、psaD,psaE、CAB8(Lhca3)蛋白:②F1FI-ATPase:atpA(α-chain)、atpB (β-chain),atpC(γ-chain)蛋白;③PSIcore:psaA、psaB、psaD、psaE 蛋白;④F1-ATPase: atpA、atpB、atpC 蛋白;⑤PSI:psbC(CP43)、psbD(D2)、psbE(CYT-B559 α-chain)蛋白;⑥Cytb6f:petA(CYT-F)、petB(CYT-BB)、petC(Rieske Fe-S-Protein)蛋白:⑦ PSI-CP43:psbB(CP47)、psbD(D2)、psbE(CYT-b559 α-chain)蛋白;⑧LHCI(3):Lhcb1 (type Ⅰ)、Lhcb3(type Ⅲ)蛋白;⑨LHCI(2):Lhcb5(CP26)、chlorophyll A-B binding protein(type Ⅲ)、Lhcb1(type Ⅰ)、蛋白:⑩LHCI(1):Lhcb1(type Ⅰ)、Lhcb3(type Ⅲ)、Lhcb4(CP29)、Lhcb6(CP24)蛋白。在已鉴定的蛋白质中,pI 分布范丽在4.1-9.72 之间,其中碱性蛋白质(pH8.0-10.0)占13.3%,酸性蛋白质(pH4.0-6.0)占66.7%,中性左右的蛋白质(pH6.0-8.0)占20.0%,极端酸性蛋白质 pH 为4.1,极端碱性蛋白质 pH 为9.72。有 14种蛋白质的 GRAVY 值为正值,占已鉴定蛋白质总数的46.7%,这远高于传统2D IEF/SDS-PAGE 所能分离的疏水性蛋白质数量。对14种疏水性蛋白质跨膜域预测表明,它们的跨膜域数目不等。最少的为一个,最多的达9个,为光系统IP700叶绿素 a 脱辅基蛋白 A2。以上结果和实验方法为水稻叶绿体光合作用、遗传变异及其基因组、亚细胞器蛋白质组学等研究工作的深入开展提供了参考及技术平台。
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