【摘 要】
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目的:制备和初步鉴定抗Axl的单克隆抗体(mAb).
方法:借助生物信息学、结构生物学对Axl胞外段进行序列、结构分析,将Axl与Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表达载
【机 构】
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河北中医学院基础医学院生物化学与生物学教研室
【出 处】
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2016全国中医药生物化学与分子生物学年会
论文部分内容阅读
目的:制备和初步鉴定抗Axl的单克隆抗体(mAb).
方法:借助生物信息学、结构生物学对Axl胞外段进行序列、结构分析,将Axl与Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建重组质粒(pGEX-4T-1-F1),并转化至大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导、表达并纯化获得目标蛋白(GST-F1).利用目标蛋白免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、杂交瘤细胞克隆化培养,通过有限稀释法筛选阳性克隆,并采用ELISA、流式细胞术、Western印迹等实验鉴定抗Axl mAb特异性;进一步通过竞争ELISA、抑制增殖、划痕实验、迁移实验等实验评价抗Axl mAb体外生物学活性.
结果:获得纯度较高的GST-F1融合蛋白,通过免疫小鼠、细胞融合、亚克隆筛选,最终得到2株具有良好亲和力和特异性抗Axl mAb.竞争ELISA的结果显示,抗Axl mAb能与Gas6竞争结合Axl蛋白.借助Axl高表达的A549细胞进行抗体生物学活性评价,结果显示抗Axl mAb能够下调内源性的Axl表达水平,并同时抑制其磷酸化;抑制增殖实验结果显示,筛选获得的抗Axl mAb对A549细胞的增殖无明显影响;Transwell实验和划痕实验结果显示,抗Axl mAb抗体能显著抑制A549细胞迁移能力.
结论:利用杂交瘤技术筛选得到2株抗Axl mAb,具有良好的特异结合活性,且在体外具有一定的生物学活性.
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