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葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GOD）属于氧化还原酶类（ECl.1.3.4）,能专一行地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,广泛存在于动植物和微生物体内。该酶主要应用于食品卫生、饲料工业和生物医药等领域。酶是生物催化剂,固定化技术是常用的提高酶稳定性的方法之一,共价固定化由于其使酶与载体结合牢固,不易造成酶的流失且具有良好的重复使用性而倍受关注。传统观点认为,酶只有在天然状态下,即只有在水中才是有活性的。但后来的许多研究表明多种酶在疏水有机溶剂中存在催化活性,且比水介质下的酶具有更高的稳定性,而且进一步的研究显示,为保持酶在有机相中的活性,一定量水的存在是必需的。人们尝试用酶构象的柔性理论去解释上述现象,认为酶悬浮在含微量水（含水量小于1%）的有机溶剂时,蛋白质分子内氢键起主导作用,使蛋白质变得"刚硬（rigidity）",活动的自由度变小,而有机溶剂中含有微量的水为酶的催化反应提供足够的构象柔性,使酶在行使其高效的催化活性时能维持正确的构象,进而发挥高效的催化活力。本文尝试利用蛋白质在有机溶剂中的"刚性"特点,在微水有机相中对蛋白质进行共价固定化,考察微水有机相环境能否一定程度地改善共价结合过程中,蛋白质因构象变化而失活的情况。我们将最适pH条件下冻干的葡萄糖氧化酶（GOD）分别转入1,4-二氧六环、乙醚、乙醇有机相和水相中,以戊二醛活化的壳聚糖微球为载体进行共价交联固定化。结果显示:在戊二醛浓度为0.1%、加酶量为80mg/1g载体、含水1.6%的1,4-二氧六环有机相中固定化葡萄糖氧化酶的酶活可达到水相中以相似条件共价固定化葡萄糖氧化酶活力的3.9倍;在pH5.5时,水相固定化酶比活力仅是1,4-二氧六环有机相固定化酶比活的20%;有机相固定化酶与水相固定氧化酶的最适反应pH值相近;60℃孵育30min后,乙醇有机相固定化酶的热稳定半衰期是水相固定化酶热稳定半衰期的1.34倍;从操作稳定性看,连续使用7次后,1,4-二氧六环有机相固定化酶残留相对酶活力仍可维持在60%以上,而水相固定化酶残留酶相对酶活力只有10%左右;1,4-二氧六环有机相固定化酶的有效酶活回收率达到88.37%,而水相固定化酶的有效酶活回收率只有22.71%;1,4-二氧六环固定化GOD的动力学参数:表观米氏常数、最大反应速率和转换数分别为Kmapp为5.63mmol/L、Vmax为1.70μmol/min mg protein和Kcat为0.304 S-1;优于水相固定化GOD的表观米氏常数、最大反应速率和转换数:Kmapp=7.33mmol/L、Vmax=1.02μmol/min mg protein和Kcat=0.221(S-1)。我们发现,在有机相中进行酶的共价固定化比在水相中进行更有利于葡萄糖氧化酶保持其活性,其中1,4-二氧六环有机相共价固定酶的优势较为明显。该发现有可能为解决酶蛋白在共价固定过程中因构象改变而丢失生物活性提供新途径。