【摘 要】
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目的 本研究旨从细胞水平上确定2,2 ,4,4 -四溴联苯醚(BDE47)的毒性作用及对CYP3A和miR-23b的影响,为阐明miR-23b在BDE47调控CYP3A酶表达中的作用及分子机制及BDE47的毒效应及环境风险评估提供依据.方法 首先利用表达CYP3A1酶的大鼠H4IIE细胞株,通过CCK-8、Western blot、siRNA干扰、地塞米松(DEX)处理和免疫荧光等试验确定BDE4
【机 构】
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南京医科大学公共卫生学院现代毒理学教育部重点实验室,江苏南京211166
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目的 本研究旨从细胞水平上确定2,2 ,4,4 -四溴联苯醚(BDE47)的毒性作用及对CYP3A和miR-23b的影响,为阐明miR-23b在BDE47调控CYP3A酶表达中的作用及分子机制及BDE47的毒效应及环境风险评估提供依据.方法 首先利用表达CYP3A1酶的大鼠H4IIE细胞株,通过CCK-8、Western blot、siRNA干扰、地塞米松(DEX)处理和免疫荧光等试验确定BDE47的毒性剂量及BDE47对CYP3A1的诱导作用.然后通过生物信息学预测和real-time PCR验证,进一步确认目标microRNA (miR-23b),在此基础上,运用双荧光素酶报告基因实验明确miR-23b和CYP3A1(大鼠)/CYP3A4(人)的靶向关系.然后利用microRNA的功能实验(miR-23b过表达和抑制试验)验证miR-23b和CYP3A1/CYP3A4的调控作用.最后在人群样本上,通过免疫组化和miR-23b的原位杂交进一步确认miR-23b和CYP3A4表达的关系.结果 ①不同浓度的BDE47处理H4IIE细胞,可引起细胞活力呈剂量依赖性下降,DEX预处理可明显增强BDE47所致的细胞毒性；CYP3A1-siRNA转染H4IIE细胞后,BDE47 20 μmol·L-1的细胞毒性有所下降.免疫荧光及Western Blot实验显示,BDE47可以显著诱导CYP3A1的表达.②利用生物信息学软件(miRanda-mirSVR,miRBase 19,RNAhybrid,miRecords和PITA)初步确认了miR-23b可能与CYP3A的调控表达有关,研究显示,BDE47处理的细胞及BDE47染毒的大鼠肝组织中,miR-23b都显著下降.③miR-23b mimic转染H4IIE细胞24 h后,CYP3A1的表达下降,细胞毒性降低；而miR-23b抑制剂处理,则CYP3A1表达升高,细胞毒性增强.④CYP3A1 3UTR/CDS和CYP3A4 3UTR/CDS的报告基因实验结果显示,miR-23b可以分别和CYP3A1 3UTR和CYP3A4 CDS结合发挥调控作用,进一步通过报告基因实验确定了miR-23b在CYP3A4 CDS区的具体作用位点.⑤利用芯片技术对50例肝癌、癌旁和正常肝组织样本分别进行免疫组化和原位杂交,结果显示,CYP3A4在三者中表达量关系为正常肝组织＞癌旁组织＞肝癌组织,而miR-23b的表达量则为肝癌组织＞癌旁组织＞正常肝组织,进一步验证了CYP3A4和miR-23b之间的调控关系.结论 BDE47可以诱导CYP3A的表达,而miR-23b可通过分别作用于CYP3A1 3UTR(大鼠)和CYP3A4 CDS区(人)参与了BDE47对CYP3A的调控,进而影响了BDE47所致的毒效应.
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