【摘 要】
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玉米弯孢菌叶斑病(Corn Curvularia Leaf Spot)是我国东北、华北和西南等地区常见的一种玉米叶部病害,由弯孢属的多个种引起,其中新月弯孢(Curvularia lunata)为优势种。非核
【基金项目】
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国家自然科学基金(31271992);辽宁省自然科学基金(20170540811)
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玉米弯孢菌叶斑病(Corn Curvularia Leaf Spot)是我国东北、华北和西南等地区常见的一种玉米叶部病害,由弯孢属的多个种引起,其中新月弯孢(Curvularia lunata)为优势种。非核糖体肽合成酶2(Nonribosomal Peptide Synthetase 2,NPS2)是非核糖体肽合成酶家族中结构保守、功能稳定的一类酶。本研究以玉米弯孢叶斑病菌菌株CX-3为研究对象,利用生物信息学方法,在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上公布的数据库中,搜索并得到了新月弯孢CX-3菌株的NPS2基因(GenBank:KY471558.1),全长15 333bp,一个开放阅读框。采用DNAMAN软件分析并设计带有Sal I和EcoR I酶切位点的特异引物,以新月弯孢菌CX-3菌株基因组DNA为模板,扩增出1 139bp片段;将该片段纯化后,T载体连接,得到pMD19-T-NPS2,用Sal I和EcoR I双酶切骨架载体pPPZPl00和pMD19-TNPS2,连接NPS2片段,获得pPPZP100NPS2,最后用Xba I和Kpn I双酶切载体pPPZP100NPS2和PCT74,在侧翼片段中间插入绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素抗性基因(HYG B),最终成功构建含有绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素抗性基因(HYG B)的NPS2基因的敲除载体pPPZP100HGNPS2。并采用电击法成功转入农杆菌AGL-1菌株中。拟通过农杆菌介导的遗传转化方法,获得NPS2基因敲除突变体,并比较突变体与野生型菌株的表型及致病力的差异,以明确NPS2的功能及其调控机制,为玉米弯孢病菌致病分子机制的研究提供理论基础。
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