【摘 要】
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目的 构建并鉴定表达人转录因子PU.1基因的重组腺病毒载体. 方法 将PU.1基因SPI1和真核表达载体pIRES-EGFP进行双酶切、连接酶连接,PCR扩增目的片段SPI1-IRES-EGFP,与中间载体pDONR221和腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行重组,经PacI线性化后转染对数生长期的人胚肾293(HEK293)细胞,获得重组腺病毒pAD-SPI1-IRES-EGFP,大
【机 构】
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南方医科大学南京临床医学院南京军区南京总医院,呼吸与危重症医学科
【出 处】
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2016中华医学会呼吸病学年会暨第十七次全国呼吸病学学术会议
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目的 构建并鉴定表达人转录因子PU.1基因的重组腺病毒载体. 方法 将PU.1基因SPI1和真核表达载体pIRES-EGFP进行双酶切、连接酶连接,PCR扩增目的片段SPI1-IRES-EGFP,与中间载体pDONR221和腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行重组,经PacI线性化后转染对数生长期的人胚肾293(HEK293)细胞,获得重组腺病毒pAD-SPI1-IRES-EGFP,大量扩增后获得高浓度重组腺病毒.TCID50法测定病毒滴度,荧光显微镜和实时荧光定量PCR(real-time PCR)鉴定PU.1基因在HEK293细胞中的表达. 结果 酶切、PCR和测序等表明重组腺病毒携带有正确的PU.1基因,荧光显微镜和real-time PCR证实PU.1基因能够稳定高表达,TCID50法计算腺病毒滴度为8×1011IU/mL. 结论 成功构建并获得高浓度的人转录因子PU.1基因重组腺病毒,为后续体内外研究PU.1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础.
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