论文部分内容阅读
目的:视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)是一种进行性视网膜退行性疾病,具有高度的遗传和临床异质性。剪接复合体核心组分U5 snRNP的组件在体内广泛表达,但PRPF6、PRPF8及SNRNP200的突变都特异地导致常显性RP,而EFTUD2却导致RP以外的其它常显性疾病,其分子机制尚未明确。本研究拟通过构建U5 snRNP组分表达敲低的细胞模型,系统分析研究U5 snRNP组分特异性导致RP的分子机制。方法:针对U5 snRNP组分PRPF6、PRPF8、SNRNP200及EFTUD2,设计siRNA靶点敲低视网膜色素上皮细胞ARPE-19内相应基因的表达,所得细胞模型进行转录组测序(RNA-Seq),应用edgeR,rMATs等软件分析靶基因敲低后对细胞整体表达水平,剪接水平的影响。对PRPF6、PRPF8、SNRNP200基因敲低所导致的剪接异常基因进行基因语义学(geneontology,GO)和信号通路(pathway analysis)分析,得出受到影响的关键信号通路,以揭示U5 snRNP组分突变导致RP的共同分子机制。结果:通过edgeR对基因表达水平进行分析,发现敲低U5 snRNP组分并不会显著影响细胞整体表达水平。受到影响的基因数量(FDR<0.05)分别为PRPF6(89下调92上调),PRPF8(181下调232上调),SNRNP200(6下调79上调)及EFTUD2(1下调3上调)。rMATs软件对剪接水平分析发现剪接因子的敲低会显著降低外显子跳跃(skipped exon, SE)水平,同时内含子保留(retented intron,RI)水平则显著升高。表明剪接因子的敲低会显著降低细胞内的剪接效率,减少转录的多样性。通过与非RP致病基因EFTUD2所影响的剪接事件进行对比,我们发现虽然同属U5 snRNP组分,PRPF6(1773),PRPF8(3228),SNRNP200(2791)被敲低后剪接异常的基因会影响不同的生物学过程(Biological Process),但存在相似的细胞成分(Cellular Component)富集,主要存在于纺锤体、微管及泛素连接酶复合体中。通过对至少在两个RP致病基因中存在剪接异常的基因(1827)进行分析,我们发现RP致病基因的敲低主要影响RPE细胞的自噬、泛素介导的蛋白水解、溶酶体等相关通路。结论:本研究首次系统分析U5 snRNP中RP致病基因特异性致病的分子机制,发现了其突变所影响的关键通路,为开发相应治疗药物提供了有用的参考。