乳腺癌在全球女性中的发病率和死亡率居于恶性肿瘤之首,化疗在乳腺癌的治疗过程中占有重要地位。化疗过程中多药耐药(Multidrug resistance,MDR)的产生是制约临床治疗、导致化疗失败的重要原因。MDR的发生往往伴随着多药耐药基因如MDR1、MRP1、BCRP、LRP等的高表达,其中由MDR-1编码的P-糖蛋白(P-Glycoprotein, P-gp)是目前公认的可以诱发肿瘤发生MDR的重要分子。P-gp是ABC超家族成员,通过水解ATP,将细胞毒性药物泵出细胞外,诱发MDR。前阐明细胞获得多药耐药的机理以及逆转多药耐药已经成为肿瘤研究领域的热点。然而到目前为止,尚未有真正能够有效逆转多药耐药的药物进入临床治疗,导致这种现象的一个原因是我们对癌细胞多药耐药表型的认识不够深入,单纯逆转多药耐药并不能取得良好的治疗效果。为了深入研究P-gp介导癌细胞多药耐药的分子机理,我们构建了携带Flag标签的MDR1真核表达载体。通过将Flag-MDR1质粒转染细胞,应用免疫共沉淀结合蛋白质质谱的方法筛选和鉴定了多个可能与P-gp相互作用的蛋白质。随后应用生物信息学的方法对这些蛋白质进行了功能上的分类,并采用Cytoscope软件结合数据库搜索的方法绘制了P-gp的相互作用蛋白质网络图。其中有两个蛋白质Src和Rack1(Receptor for Activated CKinase 1)引起了我们的注意。Src是一个公认与肿瘤发生、发展、侵袭、转移和耐药密切相关的原癌基因,Rack1最早是作为活化的蛋白激酶C的结合蛋白质而被发现的,Rack1可结合激活的PKC并稳定其活性构象。一系列的研究发现Rack1是细胞内一个重要的支架蛋白或者接头蛋白,通过与多种蛋白质相互作用参与细胞内多条信号传导通路。在耐药细胞中,敲除Rack1的表达,利用免疫印迹,免疫荧光,罗丹明外排,CCK8检测细胞活力等实验,证实下调Rack1的表达,增加肿瘤细胞对表柔比兴的敏感性,P-gp的蛋白水平并未收到影响,P-gp的活性下降。同样的方法,在乳腺癌耐药细胞系中下调Src的表达,或者使用Src的抑制剂,P-gp的活受到抑制,蛋白水平没有变化,肿瘤细胞对药物的敏感性增加。进一步研究发现,P-gp与Src、Rack1形成复合体,并且此复合体的稳定性依赖于Rack1的存在。通过免疫荧光及共聚焦显微镜分析,乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中,P-gp定位与细胞膜,并与脂筏和Caveolin-1存在共定位。结合文献分析,P-gp的活性受到Caveolin-1的调控,Caveolin-1与P-gp的结合抑制P-gp的活性,Caveolin-1的14位酪氨酸磷酸化解除对P-gp活性的抑制。耐药乳腺癌的细胞中,下调Rack1和Src的表达,或者使用Src的抑制剂,降低了Caveolin-1磷酸化。同时,我们采用蔗糖密度梯度离心的方法,分离出细胞膜脂筏成分,进一步分析Rack1对P-gp脂筏定位的影响,结果下调Rack1,P-gp在脂筏上的定位减少。结论 P-gp/Src/Rack1复合体定位于脂筏,Src磷酸化Caveolin-1解除对P-gp的抑制作用,P-gp通过水解ATP将细胞内毒性药物泵出细胞外。敲除Rack1,一方面破坏了复合体的稳定性,P-gp的活性受到抑制,另一方面,减少了P-gp在脂筏上的定位。说明Rack1调控了P-gp的活性和肿瘤细胞对药物的敏感性。