乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是一种能高效表达外源蛋白的酵母表达系统,作为美国FDA认证的食品安全级酵母,具有遗传稳定、蛋白可翻译后加工、产物可分泌到胞外、可高密度发酵且发酵过程无产气现象,不会发生爆罐、发酵过程中所需的诱导剂是乳糖或半乳糖,相对甲醇诱导更安全、表达产物可直接应用于食品及饲料工业中等优点.本研究成功构建了重组抗菌肽PSI的乳酸克鲁维酵母基因工程菌,在摇瓶培养的基础上,建立了100L发酵罐中高密度发酵的工艺及产物分离纯化方法.工程菌株在100 L发酵罐中发酵24 h后开始流加葡萄糖使菌体密度增加,当酵母生长进入稳定期,菌体湿重达到190 g/L,开始流加乳糖诱导,诱导25 h后结束发酵,菌体湿重达280 g/L,发酵液中抗菌肽效价达2.36×109 U/L,实现了100 L发酵罐高密度发酵生产抗菌肽.SDS-PAGE结果表明：随着诱导时间的增加,发酵液上清中蛋白表达量逐渐增加,到第25h,表达产物量最多.用YDFM、BSM、YDFMY和BSMY四种培养基进行发酵的抗菌肽效价分别为1.22× 109 U/L、2.36× 109 U/L、2.01×109 U/L和2.78× 109 U/L,表明BSM诱导培养基更适于重组工程菌表达抗菌肽,且更为经济和高效.为了确定乳糖是否可作为半乳糖的替代品,将一定量的乳糖和半乳糖分别作为诱导物诱导酵母表达抗菌肽PSI,在不同诱导物下发酵液中抗菌肽效价分别为2.36× 109 U/L和3.28× 109 U/L,表明乳糖也可作为诱导物诱导酵母表达抗菌肽.对发酵工艺进行了优化,用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导,乳糖添加量为5 kg,补料流加速度为1 L/h,诱导25 h,菌体细胞湿重达280 g/L,发酵液中蛋白产量达27.8 mg/L,抗菌肽PSI效价达到2.36×109 U/L.采用多种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化,结果表明阴离子交换色谱纯化效率最高,纯化后蛋白效价为8.83× 109 U/L,其次为丙酮沉淀、超滤、硫酸铵分级沉淀,纯化后蛋白效价依次为6.35× 109、4.56×109、3.28× 109 U/L.