番茄SYTA与FdⅠ及DCL 1相互作用的研究

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实验室前期研究显示番茄SYTA (S.lycopersicum SYTA,S.l SYTA)与铁氧还蛋白Ⅰ(ferredoxin,FdⅠ)与DCL 1 (Dicer-like,DCL 1)存在相互作用。为进一步明确S.l SYTA为中心的互作链CPTMV-FdⅠ-S.l SYTA-MPTMV中各蛋白是如何相互作用进而影响寄主本身抗病及感病能力。本实验根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer premier 5.0软件设计克隆引物采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列,利用在线TMHMM Server2.0分析各蛋白结构域。然后,设计引物,PCR缺失突变技术分别获得各S.l SYTA,FdⅠ和DCL1蛋白的缺失突变体。分别构建进入双分子荧光互补所用的pCV-nYFP-C1和pCV-cYFP-C1载体中,构建相应缺失突变体的重组载体。通过热激法将融合表达的植物载体转化至农杆菌EHA105,共聚焦显微镜下观察蛋白互作情况。利用TRV病毒载体在番茄植株中沉默S.l SYTA接种TMV,紫外灯下观察并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测S.l SYTA,FdⅠ和DCL1及TMV-GFP的积累和移动情况。结果显示克隆得到1 620bp的s.l SYA基因开放阅读框全长,通过序列比对及蛋白结构域分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYT家族的典型特征,含有N端的跨膜区和两个C2结构域。C2A和C2B结构域分别编码100个和99个氨基酸。在共聚焦显微镜下显示,S.l SYTA与FdⅠ和DCL1存在相互作用,且C2A结构与Fd 1在共聚焦显微镜下发现荧光,C2B与FdⅠ不存在相互作用,证明C2A为主要行使功能的结构域。通过紫外灯和qRT-PCR观察和检测TMV-GFP的累积和移动情况显示,在SYTA沉默番茄植株中,TMV的侵染速度以及病毒累积情况相较于空载体对照明显缓慢和下降,证明S.l SYTA对TMV的侵染和移动有促进作用,同时比较FdⅠ和DCL 1的表达量发现,番茄FdⅠ的表达量与S.l SYTA呈负相关,而番茄DCL 1(Dicer-like 1)基因的表达量与S.lSYTA呈正相关。
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