【摘 要】
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目的 猕猴桃果胶(Actinidia pectin,AP)在体条件下,可有效加快模式雄性小鼠排便速度；显著增加小鼠离体肠段收缩频率,具有Ach 类似作用.本文试图探究AP 对M-AchR 表达、Ca2+信号转导和SMC 微丝滑动的影响,在受体水平解释AP 增强肠蠕动的机理并对其性质做一界定.方法 以Caco-2、DLD-1 和小鼠小肠SMC 为研究对象,设计6 组开展研究,即dH2O(CK)、10
【机 构】
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南京师范大学 食品科学与营养系 南京师范大学 生命科学学院
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目的 猕猴桃果胶(Actinidia pectin,AP)在体条件下,可有效加快模式雄性小鼠排便速度；显著增加小鼠离体肠段收缩频率,具有Ach 类似作用.本文试图探究AP 对M-AchR 表达、Ca2+信号转导和SMC 微丝滑动的影响,在受体水平解释AP 增强肠蠕动的机理并对其性质做一界定.方法 以Caco-2、DLD-1 和小鼠小肠SMC 为研究对象,设计6 组开展研究,即dH2O(CK)、10μM Ach(+)、10μM Atr(+)、10mM 柠檬酸、10mM 葡萄糖(Glc)和20μM AP.采用流式细胞术(FC)记录500 细胞/组的Caco-2 膜M-AchR 和胞内Ca2+流量和荧光分布,分析受体内吞与Ca2+信号传导机制；激光共聚焦法(CLSM)记录30 SMC/组的F-actin/G-actin、M-AchR/β-arrestin 荧光图谱,计算F-actin 和GactinFI 并解释与SMC 伸缩的关系；免疫印迹法(WB)检测膜M-AchR 蛋白表达量,进一步佐证其内吞与Ca2+内流、SMC 微丝滑动和平滑肌收缩的关联性.运用生物统计学方法 设计试验,分析组间差异性,控制试验质量.结果 1)FC 研究表示,M-AchR 分布于Caco-2 膜和胞浆,在Ach 和AP 激动下,M-AchR 内吞增加并聚集于核附近胞浆,M-AchR 与DAPI 核染的荧光叠加信号比显著增强,Ach 和AP 分别导致膜M-AchR 的MFI下降20％和10％(p＜0.05)；还引起胞内[Ca2+]显著升高(p＜0.01,p＜0.05).2)CLSM 观察,M-AchR在SMC 分布与Caco-2 一致,β-arrestin1/2 位于细胞膜附近,G-actin 和F-actin 是胞浆蛋白.给予 Ach 或AP,促使β-arrestin1/2 诱导膜M-AchR 向胞内转移,二者荧光叠加后呈现高信噪比；进而引发G-actin 和F-actin 偶联而促进SMC 微丝滑动,分别使SMC 长度显著缩短32％和20％(p＜0.05).3)WB 检测后发现,Ach 和AP 使膜受体蛋白表达量明显减少50％-80％和35％-65％(p＜0.05),进一步证实Ach 和AP 会引起M-AchR 活化并内吞.初步探明AP 具有较弱Ach 作用,直接作用于下游Ca2+通道,由Ca2+信号介导G-actin 与F-actin 偶联,增进了滑丝运动,提高了肠平滑肌收缩频率,可能属于“不完全偏好性配体”.结论 M-AchR 分布于肠上皮和SMC 膜和胞浆,且具有Ach 类似生理作用.在β-arrestin1/2 介导下强化膜M-AchR 内吞,启动下游L-Ca2+通道,增加胞内[Ca2+],导致G-actin 和F-actin 偶联而增促进SMC 微丝滑动,故能提高肠平滑肌收缩频率.AP 能够改变平肠滑肌自律性且效果温和,可归属于“不完全偏好性配体,具有开发功能食品的前景.
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