手性羟基酸在化工、制药和农药领域内均有重要应用价值,扁桃酸及其衍生物是最为重要的代表。在工业应用中相对比较成熟的基于酯酶催化法的乙酰化羟基酸或羟基酸酯的对映选择性水解反应是一种具有应用潜力的拆分方法。本实验室在前期工作中采用传统筛选方法得到一株恶臭假单胞菌Pseudomonas sp.ECU1011,能够高选择性地催化水解(S)-乙酰基扁桃酸。本研究首先根据生物信息学分析,预测其中的酯酶,克隆、功能筛选得到相应酯酶rP PE01。该酶具有良好的热稳定性及有机溶剂耐受性,并且能够催化一系列芳香族羟基酸,有极其重要的工业化应用价值。但也存在活力低和操作稳定性差的问题。我们首先采用基于同源建模和分子对接的半理性设计得到对乙酰基邻氯扁桃酸kcat/KM提高100倍的突变株rP PE01W187H,解决其活力低的问题。进一步通过选择合适的阳离子来保护酶在反应过程中的失活,大大降低了生物催化反应过程中酶的失活等问题。最后,对rP PE01W187H进行固定化研究实现催化剂的重复利用并利用所得到的固定化酶rP PE01W187H@ESR-1构建填充床反应器进行完全连续反应。经过对初始p H、物料流向、反应器高径比等重要参数进行优化,在2-乙酰氧基邻氯苯乙酸的拆分反应中该反应器的时空产率可达3.34 kg L-1 d-1。对固定化酶在填充床反应器的操作稳定性进行考察结果表明,在100 mM底物浓度下连续反应42天没有明显的活力损失,最终构建了一种高效、通用、绿色的手性羟基酸生产工艺。