【摘 要】
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目的:构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,研究获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件,同时摸索表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选可能药物创造条件.方法:使用高保真P fuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建了原核表达载体pMAL-C2NS5b和pET30aES
【机 构】
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中国药品生物品检定所 中国医学科学院医药生物技术所
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目的:构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,研究获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件,同时摸索表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选可能药物创造条件.方法:使用高保真P fuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建了原核表达载体pMAL-C2NS5b和pET30aES5b.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择各种诱导表达条件.进一步利用Ni<,2+>金属离子螯和亲和层析将其纯化,用West-bolt(WB)方法进行验证.同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究.对该酶相关的分子生物学参数和二级结构进行分析.结果:测序及读码框架分析结果表明得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序,在最佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(65kDa),其最高表达量为18.9％.得到了纯度大于92.83％的酶蛋白,用WB法检测样品,能与HCV NS5b单抗反应,证明其为NS5b蛋白,并保持活性.对其二级结构的分析表明,我们获得活性集团完整的HCV聚合酶.结论:HCV聚合酶的高效表达和纯化,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选可能药物奠定基础.
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