研究目的及意义：异种核移植在物种的改良、濒危动物的保护;研究核质关系、基因表达调控、细胞分化和物种进化以及胚胎干细胞等方面具有重要的研究意义。手工克隆(HandmadeCloning，HMC)省去了繁杂的显微操作过程，并降低了生产成本，而且具有较高的融合率和囊胚率，为体细胞克隆技术的应用研究开辟了一条捷径。本研究运用手工克隆技术利用马的体细胞和牛的卵母细胞构建重构胚胎，对马牛异种手工核移植进行了初步研究，为以后的研究打下基础。 材料和方法：1.供体细胞培养 剪取马耳缘1cm2左右的组织块，用DMEM全培养液，进行马成纤维细胞培养、传代。取5-10代的细胞作为供体细胞。2.重构胚的构建及体外培养将体外成熟培养18h左右的COCs去除颗粒细胞，挑选排出极体的去核，经去除透明带，作受体胞质。构建重构胚时，先将半卵在植物凝集素(PHA)中处理3-4s后，再粘附供体细胞。在交流电(AC)下，使体细胞-半卵复合体的排列方向与电极垂直，然后将另一半卵粘附其上，排列顺序为半卵-体细胞-半卵，并使其排列方向与电极垂直.最后给以50V/mm，9s，1个脉冲的直流电(DC)进行电融合。重构胚经激活后，移入mcR1aa液中，用微穴法(WOWs)体外培养。48h后换液并检查卵裂率，7d后检查重构胚发育情况。 结果：马-牛重构胚经激活、体外培养后，融合率为93.9％(171/182)。培养48h后统计分裂率为91.2％(156/171)，其中2-4-细胞为33.9％(53/156)、4-细胞以上为66.1％(103/156)。培养7d后发现无囊胚出现，发育至16-细胞以上为19.8％(31/156)。利用马微卫星特异引物对分裂的各时期胚胎分别进行核遗传物质检测，发现其与供体马具有相同的基因型，证明所构建的重构胚具有供体马的遗传物质。 讨论：重构的马牛异种核移植胚胎，体外培养得到较高的融合率和分裂率，表明牛的卵母细胞能够支持马体细胞的重编程和手工克隆技术具有简单、高效的优点。但是重构胚在16-细胞期出现发育停滞的现象，未能发育到囊胚.发生阻滞的时期正是新mRNA、rRNA和蛋白质合成启动的阶段。前几个分裂时期的合成代谢主要是由卵母细胞质中的原有mRNA、rRNA指导完成。随着胚胎的发育，供体细胞核基因组开始启动转录，重构胚的分裂逐步由受体胞质的mRNA、rRNA指导向供体细胞mRNA、rRNA指导转变，此时若某发育相关基因不能正确表达便会出现发育停滞现象。因此，在这一时期胚胎对培养条件特别敏感，稍有不适便会出现不可逆的发育停滞。在下一步的实验中计划通过改进培养条件和方法，促使重构胚发育必需基因表达，克服发育受阻现象.并对重构胚胎的线粒体命运和核基因组DNA甲基化进行检测，以研究异种核移植胚胎的核质互作和核重编程问题。