【摘 要】
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血友病B为凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)基因突变或缺失导致的FⅨ蛋白功能异常或缺失引发的凝血功能障碍.传统上,血友病小鼠的模型构建采用同源重组的方法,该方法虽能大片段地造成基因缺失,抑制FⅨ活性,但其耗时长,筛选纯合小鼠难度高.CRISPR为RNA介导的靶向基因编辑系统,向导RNA(guideRNA,gRNA)可以通过与靶标DNA序列结合,形成三链结构,诱导核酸内切酶Cas9对DNA进行双链切
【机 构】
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复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室,遗传学研究所,上海200433 上海南方模式生物研究中
【出 处】
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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会
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血友病B为凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)基因突变或缺失导致的FⅨ蛋白功能异常或缺失引发的凝血功能障碍.传统上,血友病小鼠的模型构建采用同源重组的方法,该方法虽能大片段地造成基因缺失,抑制FⅨ活性,但其耗时长,筛选纯合小鼠难度高.CRISPR为RNA介导的靶向基因编辑系统,向导RNA(guideRNA,gRNA)可以通过与靶标DNA序列结合,形成三链结构,诱导核酸内切酶Cas9对DNA进行双链切割,造成目标基因的突变.本文利用CRISPR系统,在FⅨ基因第八外显子核心功能区设计靶标,通过体外转录cas9酶及gRNA并显微注射小鼠一细胞期受精卵进行FⅨ定点的基因编辑.取出生后三周龄小鼠尾尖0.5cm抽提DNA,采用HRM(高分辨率溶解曲线)辅以Sanger测序法检测出生小鼠FⅨ基因突变情况.通过检测FⅨ蛋白表达量、激活的部分凝血活酶时间(APTT)及促凝活性(FⅨ:C)进行突变小鼠表型鉴定.纯合突变小鼠中，有两对雌雄个体具有相同的基因突变，可以直接交配得到纯合突变的子代小鼠，即显微注射两代内可获得血友病B突变纯合小鼠，构建纯和突变小鼠高效、快速。
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