【摘 要】
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为了建立一种快速、高效、准确检测橡胶树红根病菌的技术。本研究以SYBR Green I为指示剂,建立了橡胶树红根病菌即橡胶灵芝菌(Ganoderma pesudoferreum)的环介导等温扩增(LAMP)可
【机 构】
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中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带农林有害生物入侵检测与控制重点实验室海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室; 南京农业大学植物保护学院; 海南大学植物保护学院
【基金项目】
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国家重点研发计划项目(No.2018YFD0201100);国家天然橡胶产业技术体系建设专项资金资助项目(No.CARS-33-GW-BC1);海南省科协青年科技英才创新计划项目(No.QCXM201714)
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为了建立一种快速、高效、准确检测橡胶树红根病菌的技术。本研究以SYBR Green I为指示剂,建立了橡胶树红根病菌即橡胶灵芝菌(Ganoderma pesudoferreum)的环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。根据橡胶树红根病菌特异的线粒体转录间隔区序列设计了4条引物(两条内引物、两条外引物)进行LAMP扩增。对LAMP反应条件和体系进行优化,并进行特异性和灵敏度验证。研究确定最佳反应体系(25μL中模板100ng/μL,外引物F3/B3各为0.2μmol/L,内引物FIP/BIP各为1.2μmol/L,dNTPs为1.4mmol/L,Mg2+为4mmol/L,甜菜碱为0.8mol/L,Bst DNA polymerase为8U/μL,)和反应条件(最佳反应温度64℃,反应1h)。特异性检测结果显示,橡胶树红根病病菌LAMP产物均呈阳性(绿色),而其他病原菌组织LAMP产物均为阴性(橙色)。灵敏度验证结果显示,该体系的DNA的最低检测限为1×10-5ng/μL,是普通PCR的103倍。
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