【摘 要】
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目的探讨miR-194-5p在卵巢癌细胞糖酵解中的功能,进一步阐述miR-194-5p调控卵巢癌细胞糖酵解的分子机制。方法首先,建立稳定过表达或低表达miR-194-5p的卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3,检测各组卵巢癌细胞糖酵解的水平,包括细胞摄取的葡萄糖、产生的ATP、乳酸,及用Seahorse XFe24细胞能量代谢仪检测细胞外酸化速率,实时荧光定量PCR检测各组细胞中糖酵解通路关键基因丙酮
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目的探讨miR-194-5p在卵巢癌细胞糖酵解中的功能,进一步阐述miR-194-5p调控卵巢癌细胞糖酵解的分子机制。方法首先,建立稳定过表达或低表达miR-194-5p的卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3,检测各组卵巢癌细胞糖酵解的水平,包括细胞摄取的葡萄糖、产生的ATP、乳酸,及用Seahorse XFe24细胞能量代谢仪检测细胞外酸化速率,实时荧光定量PCR检测各组细胞中糖酵解通路关键基因丙酮酸激酶（PKM2）、乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、葡萄糖转运蛋白3（GLUT3）的m RNA表达水平。其次,生物信息学软件预测并筛选miR-194-5p的候选靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-194-5p和靶基因的靶向调控关系,并检测靶基因对卵巢癌细胞糖酵解的影响,蛋白免疫印迹实验检测miR-194-5p对靶基因下游信号通路p AKT蛋白表达的影响。最后,生物信息学软件预测miR-194-5p的启动子区及潜在的转录结合位点,双荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀和凝胶电泳迁移实验验证转录因子与miR-194-5p启动子的相互作用。结果成功建立稳定过表达或低表达miR-194-5p的ES-2和SKOV3细胞株,且miR-194-5p过表达抑制细胞摄取葡萄糖、产生ATP、乳酸、细胞外酸化速率的水平（P＜0.05）,同时减弱糖酵解通路关键基因PKM2、LDH、GLUT1、GLUT3 m RNA的表达水平（P＜0.05）;而miR-194-5p低表达时,细胞的糖酵解能力增强（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实IGF1R是miR-194-5p的直接靶基因,miR-194-5p负性调控IGF1R蛋白的表达（P＜0.05）。卵巢癌组织中IGF1R高表达,在卵巢癌细胞中抑制IGF1R表达后,细胞的糖酵解水平降低,p AKT蛋白表达水平也降低（P＜0.05）;miR-194-5p过表达可抑制p AKT的表达水平（P＜0.05）。且NF-κB1可结合miR-194-5p启动子区域,抑制NF-κB1后miR-194-5p启动子活性增强（P＜0.05）。结论miR-194-5p抑制卵巢癌细胞糖酵解;IGF1R是miR-194-5p的靶基因,可促进卵巢癌细胞的糖酵解,miR-194-5p通过靶向IGF1R抑制AKT的活化;NF-κB1与miR-194-5p上游启动子特异性结合并抑制miR-194-5p的转录活性。
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