猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus,APPV）是新近发现能引起仔猪先天震颤（congenital tremors,CT）的病原体。2015年,美国首次在先天性震颤的猪群中发现了APPV,本课题组于2016年在我国猪群中首次检测到APPV的感染,并分离获得了APPV GD1、GD2和GD3毒株。APPV广泛分布于欧洲、亚洲和美洲的重要养猪国家,造成了巨大的经济损失。目前,虽然我们已经建立了E2基因的荧光定量RT-PCR检测方法,但针对该病毒的感染尚无血清学检测方法;此外,作为新发传染病,病毒在组织内的分布和表达情况仍然不清楚。APPV编码的Erns蛋白具有的RNase活性,在病毒的复制和持续感染过程中起到了重要作用,同时Erns能诱导宿主产生中和抗体。考虑到Erns的功能,在本研究中我们选取Erns蛋白作为靶标,建立了检测APPV感染的间接ELISA检测方法,并进行了自然感染猪各组织中APPV含量和分布的研究,具体研究内容如下:利用实验室保存的APPV-GD2-CT1质粒扩增获得Erns基因。同源性分析显示APPV-GD2毒株的Erns与其他瘟病毒属病毒的进化距离较远,但在不同毒株之间表现出高度保守性;结构分析表明该蛋白编码210个氨基酸,蛋白大小为23.8 KDa,不存在跨膜区和信号肽。利用Bam H I和Xho I限制酶切位点,将扩增的Erns基因连接至p ET-32a（+）原核表达载体。将构建的载体转化到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG成功诱导表达了Erns重组蛋白。利用纯化后的Erns重组蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备了兔抗Erns多克隆抗体,经过Western-blotting和ELISA检测,多克隆抗体效价高、特异性强。利用Erns重组蛋白作为检测抗原,建立了基于Erns蛋白的间接ELISA方法。结果表明,最佳抗原包被浓度为8μg/m L、最佳血清稀释度为1/10、阴阳性临界值D450=0.318、灵敏度达到1/64,特异性好、与猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及圆环病毒病的阳性血清均不发生交叉反应。该检测方法重复性好,批内变异系数最大值为7.84%,批间变异系数最大值为8.57%。利用建立的间接ELISA方法对50份猪临床血清样本进行了检测,其阳性率为10%。以Erns蛋白为靶标,建立了检测APPV绝对量的荧光定量PCR方法,采用该方法检测显示患病仔猪各器官均可以检测到APPV,其中小脑、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结及胸腺的APPV含量显著高于其他组织（P<0.01）,表明这些为APPV的重要靶器官。脊髓和脑干的APPV含量最低,两者之间差异不显著（P>0.05）,而小脑的APPV含量最高,这表明了APPV可能具有特殊的噬神经特性,并且更偏向感染小脑。免疫组织化学检测发现,APPV主要分布于神经组织中的基质和神经纤维、淋巴组织中的内皮细胞和其他组织中的上皮细胞,其中小脑髓质、脑干和脊髓的神经纤维、脑干的分子层基质及脊髓的神经元、颌下淋巴结和腹股沟淋巴结的内皮细胞和网状细胞呈强阳性着色,为APPV的主要靶细胞。APPV在淋巴和中枢神经组织中的组织学分布表明了APPV可以突破免疫屏障和血脑屏障。本研究以Erns蛋白作为APPV血清学检测的重要靶标,将其作为包被抗原建立了检测APPV感染的间接ELISA方法,为仔猪先天性震颤的流行病学调查及临床诊断提供了有效的工具。另外,以Erns蛋白为靶标,通过绝对荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测了自然感染仔猪各组织的APPV含量和分布的差异,确认了APPV在组织中的靶细胞及其类型,为探索仔猪先天性震颤的发病机制提供了基础数据。