乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一,在乳腺癌病人中普遍存在HER2过度表达的现象。HER2分子是一185kDa的跨膜糖蛋白,针对HER2分子的靶向治疗是近年来出现的一种有效的生物治疗手段。靶点药物如赫赛汀由于靶点专一,使药物对细胞的其它代偿作用及信号旁路没有抑制作用导致耐药性,大大限制了其应用。因此,靶向药物与其他药物的联合应用是目前研究的热点。衣霉素是一种能够抑制糖蛋白N-糖链合成的抗生素,作为糖蛋白N-糖链合成抑制剂,可以抑制大多数是糖蛋白的受体进行糖基化,进而使受体数量减少和活性降低,HER2信号转导通路以及其它代偿途径随之降低。因此,衣霉素与赫赛汀的联用既可增强赫赛汀的抗肿瘤效果,又能避免细胞毒药物联用时导致的毒副作用。本课题主要选用5种人乳腺细胞株：MCF-7、MCF-7/HER2、SKBR3、BT474以及MCF-10A,通过体内外实验,在动物、细胞及分子各个方面深入研究了衣霉素对乳腺癌细胞的抗肿瘤作用,并从衣霉素对HER2分子及其相关信号传导通路分子表达及活化的影响来探讨了其分子作用的机制。在此基础上,本课题还对衣霉素联合HER2分子靶向药物赫赛汀对乳腺癌的作用进行了初步的探索,为衣霉素与赫赛汀联合用药进入临床试验奠定理论基础。1HER2真核表达载体pcDNA3.1/HER2以及HER2高表达稳定转染乳腺癌细胞株MCF-7/HER2构建与鉴定采用RT-PCR的方法从人乳腺癌细胞MDA-MB-453中获得HER2的cDNA序列,并将其克隆至载体pGEM(?)-T Easy上,然后测序验证序列的正确性。将质粒pGEM(?)-T Easy/HER2和载体pcDNA3.1分别用限制性内切酶Nhe I和Xho I进行双酶切,然后用T4DNA连接酶连接,成功构建出重组质粒pcDNA3.1/HER2。将重组质粒转染至乳腺癌细胞MCF-7中,通过G418筛选和Western blot鉴定,获得稳定高表达HER2的MCF-7/HER2细胞。该细胞可以作为分子靶点HER2的细胞模型进行下一步的研究。2衣霉素与赫赛汀单独或者联合用药的体外实验2.1通过CCK8检测在衣霉素或赫赛汀单独用药或联合用药对细胞增殖的影响结果显示,衣霉素在各种乳腺癌细胞中,均存在剂量依赖性的细胞增殖抑制作用。通过各细胞IC50的比较,我们发现细胞对于衣霉素的敏感性与其HER2表达水平并不相关。赫赛汀单独给药时,除HER2高表达的BT474细胞对其较为敏感,其他细胞如正常无限增殖乳腺上皮细胞MCF-10A, HER2低表达细胞MCF-7对其均不敏感。当固定衣霉素浓度为0.5μg/ml与赫赛汀联用时,联合用药组与空白对照相比,具有明显的抑制细胞增殖的作用,其抑制率高于衣霉素和赫赛汀单独用药组。另外,利用上述实验结果和两药相互作用指数计算公式得知,衣霉素与赫赛汀联合给药处理MCF-/HER2细胞,CDI<1,证明两种药物联用具有协同抗肿瘤作用。2.2衣霉素与赫赛汀单独或者联合用药对细胞凋亡的影响通过AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞仪检测衣霉素与赫赛汀单独或者联合用药对细胞凋亡的影响。对两株HER2高表达细胞株,细胞凋亡率随着衣霉素浓度增加而升高,具有一定的剂量依赖性。同时实验证明,随着给药时间的延长,细胞的晚期凋亡率有明显的升高。当衣霉素浓度为0.5μg/ml时,SKBR3细胞的凋亡率由24h时的8.69%升高到48h时的15.57%,MCF-7/HER2细胞的凋亡率由24h时的7.01%升高到48h时的13.62%。赫赛汀单独给药时,随赫赛汀浓度递增,MCF-7/HER2和SKBR3细胞凋亡比率增加。当10μg/ml赫赛汀和100μg/ml赫赛汀单独给药处理24h时,SKBR3细胞的凋亡率分别为7.14%和12.50%,MCF-7/HER2细胞的凋亡率分别为8.74%和9.49%；当100μg/ml赫赛汀和0.5μg/ml衣霉素联用时,SKBR3和MCF-7/HER2细胞的凋亡率分别为14.57%和13.20%。联合给药组的凋亡率要高于单独给药组的凋亡率。因此,衣霉素单独对于该两株细胞有良好的促进细胞凋亡的作用,并且能加强赫赛汀诱导的细胞凋亡作用。对于乳腺癌细胞MCF-7,细胞凋亡率随衣霉素浓度增加而升高,而赫赛汀单独用药对于细胞的凋亡无明显的作用效果。当衣霉素与赫赛汀联合用药时,凋亡率较衣霉素与赫赛汀单独给药组稍有提高,但是并不显著。例如,当浓度为0.5μg/ml的衣霉素和10μg/ml的赫赛汀单药处理细胞24h时,MCF-7细胞凋亡率是4.42%和3.01%；而二者联用时凋亡率是5.10%；当赫赛汀浓度为100μg/ml(?)寸,细胞凋亡率是3.40%,与0.5μg/ml衣霉素联用时凋亡率是5.13%。通过Western blot检测了衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对细胞凋亡相关蛋白的影响。结果显示,对于MCF-7细胞和MCF-7/HER2细胞,衣霉素单独和联合用药,促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达增强,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低,且均具有剂量依赖性。赫赛汀单独给药时,MCF-7/HER2细胞也存在Caspase-3的活化,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低以及PARP的切割现象,但组内三个剂量组对凋亡相关蛋白的表达水平并无明显的差异。2.3衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对细胞周期分布的影响通过PI单染结合流式细胞术检测衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对细胞周期分布的影响。结果显示,对于MCF-2/HER2细胞来说,衣霉素单独和赫赛汀单独用药均诱导细胞G1期阻滞,随给药时间的延长和剂量的增加G1期阻滞更为明显。将衣霉素(0.5μg/ml)和赫赛汀(10μg/ml)联用处理MCF-7/HER2细胞,细胞亦存在G1期阻滞的现象,加药处理24h,约有72.51%的细胞处于G1期,分别高于衣霉素(0.5μg/ml)单独给药时的65.08%和赫赛汀(10μg/ml)单独给药时的68.52%,但无显著性差异。给药48h时,细胞仍处于G1期阻滞状态,S期细胞数量进一步减少。对于MCF-7细胞,衣霉素同样可以引起该细胞的G1期阻滞,S期细胞数减少,且具有时间与剂量依赖性。但是用不同浓度的赫赛汀单独处理细胞,细胞与对照组相比并无明显的周期变化,该结果与增殖抑制实验以及凋亡实验结果一致,表明MCF-7细胞对赫赛汀不敏感。将衣霉素(0.5μg/ml)和赫赛汀(10μg/ml)联用处理MCF-7细胞,细胞仍处于G1期阻滞。上述结果表明,衣霉素单独或与赫赛汀联用时,均可显著地导致乳腺癌细胞G1期阻滞,并且S期细胞数量减少。通过Western blot检测了衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对细胞周期相关蛋白的影响。结果显示,对于MCF-7细胞和MCF-7/HER2细胞均存在衣霉素剂量依赖性诱导p21和p27的表达,并显著性下调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达水平。上述蛋白表达量的变化均可阻滞细胞由细胞由G1期进入S期。赫赛汀单独用药时,对于MCF-7/HER2细胞,当赫赛汀浓度为100μg/ml时,p21和p27的表达有所升高,其他两个浓度时,p21和p27的表达与空白相比,并无明显变化。对于MCF-7细胞,赫赛汀单药处理抑制了p21和p27蛋白的表达。另外,对于赫赛汀单药处理MCF-7组和MCF-7/HER2组,Cyclin D1表达量与对照相比均无明显的变化趋势。当固定衣霉素浓度为0.5μg/ml与不同浓度的赫赛汀联合用药时,对于MCF-7和MCF-7/HER2细胞,p21和p27的表达均比衣霉素单药组和赫赛汀单药组要高,Cyclin D1的表达水平比单独处理组低。上述结果证明,联合给药组比单独给药更好的诱导细胞处于G1期阻滞,与流式细胞仪测定结果一致。2.4Western blot检测衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对细胞EGFR家族的影响结果显示,对于MCF-7细胞和MCF-7/HER2细胞,当衣霉素单独用药时,EGFR、HER2和HER3受体水平下降,EGFR和HER2的磷酸化水平也降低,且具有剂量依赖性。赫赛汀单独用药时,对于MCF-7/HER2,只能剂量依赖性下调HER2和EGFR受体水平及HER2磷酸化水平,EGFR的磷酸化水平和HER3受体的表达量无明显变化；然而赫赛汀单独给药MCF-7细胞,上述受体蛋白和磷酸化均没有变化。当固定衣霉素浓度为0.5μg/ml与不同浓度的赫赛汀联合给药时,与单独用药组和空白对照组相比,联合用药组降低HER2、EGFR和HER3受体表达水平及EGFR和HER2的磷酸化水平。2.5Western blot检测衣霉素与赫赛汀单独或联合用药对HER2下游的两条重要信号通路MAPK和PI3K/Akt的影响我们主要对其主要的分子ERK1/2、p-ERK1/2、Akt以及p-Akt的表达进行了检测。结果显示,对于MCF-7细胞和MCF-7/HER2细胞,衣霉素单独给药以及联合给药均能抑制ERK1/2和Akt的活化,从而干扰下游信号通道的激活。同时ERK1/2和Akt本身的表达量也明显下降。通过该实验我们可以推测,衣霉素及联合用药对细胞增殖、周期抑制以及凋亡的有效性,应该与其抑制了MAPK信号通道和PI3K/Akt信号通道相关。3衣霉素单独或与赫赛汀联合用药的体内实验3.1采用SKBR3乳腺癌裸鼠体内移植模型检测衣霉素单独用药的抗肿瘤作用通过肿瘤体积抑制曲线和体重变化曲线显示,衣霉素对SKBR3移植瘤的生长具有抑制作用。当衣霉素剂量为0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.075mg/kg时,其抑瘤率为12.9%、16%和33.5%。采用Western Blot方法检测衣霉素对SKBR3乳腺癌裸鼠体内移植模型瘤组织HER2蛋白的影响。研究发现,与空白对照组相比,衣霉素给药组HER2蛋白在肿瘤组织的表达量降低。而三个给药剂量组之间,HER2蛋白的表达无明显的差异。3.2采用MCF-7/HER2乳腺癌裸鼠体内移植模型检测衣霉素单独用药的抗肿瘤作用通过肿瘤体积抑制曲线和体重变化曲线显示,衣霉素对MCF-7/HER2移植瘤的生长具有抑制作用。治疗后,衣霉素各单独给药组及赫赛汀给药组的肿瘤生长均受到抑制。治疗21天后,各组抑制效果为0.075mg/kg组>0.02mg/kg组>0.005mg/kg组,同时0.005mg/kg组与赫赛汀10mg/kg剂量组的抑制效率相当。当衣霉素给药剂量为为0.02mg/kg时,其体重与赫赛汀组以及空白对照相比无明显差异,但抑瘤率达27%；当衣霉素剂量为0.075mg/kg时,抑瘤率高达50%,但也造成体重下降23%,具有一定的毒性。Western blot结果显示,衣霉素给药处理24h,其HER2蛋白在肿瘤组织的表达量与空白对照组相比无明显的差异,而衣霉素单药处理48h和72h,HER2表达水平较空白对照组有明显的降低,同时48h组低于72h组。该结果说明衣霉素在体内在48h时发挥最好的效果,72h时,疗效有所下降,需要再次给药以维持其疗效。3.3采用MCF-7/HER2乳腺癌裸鼠体内移植模型检测衣霉素和赫赛汀联合用药的抗肿瘤作用联合给药组裸鼠瘤块的体积低于衣霉素或赫赛汀单独给药组,且具有显著性意义。与空白对照相比,衣霉素单独给药组、赫赛汀单独给药组以及联合用药组抑瘤率分别为47.6%、22.9%和61.9%。同时,联合用药组裸鼠体重等变化与空白对照组相比无明显的差异。上述研究结果提示,在不引起毒副作用的剂量下,联合用药可以增强药物的抗肿瘤作用。