4-香豆酰辅酶A连接酶是苯丙素类生源合成途径上一个关键酶，是苯丙烷代谢途径的最后一个酶，在苯丙烷代谢途径中处于终端位置，催化4-香豆酸生成4-香豆酰辅酶A。在植物中，4-香豆酰辅酶A连接酶多以多基因家族的形式存在。　　 本课题从我国传统药用植物菘蓝Isatis indigotica Fort.中，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)的方法，克隆获得菘蓝中4-香豆酰辅酶A连接酶家族中的Ii4CL2、Ii4CL3全长cDNA。Ii4CL2（Genbank accession No.KC430622）cDNA全长为1975bp，编码564个氨基酸;Ii4CL3(Genbank accession No.KC430623)cDNA全长为1932 bp，编码543个氨基酸。另外，克隆获得Ii4CL1全长cDNA为1967bp(Genbank accession No.GU937875)，包含一个1632 bp的开放阅读框(ORF)，编码543个氨基酸残基。生物信息学分析表明，4CLs可分为不同的类群，将Ii4CL2、Ii4CL3归为ClassⅡ,主要地伴随木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成，而Ii4CL1则归为ClassⅠ和ClassⅡ之外的ClassⅢ，此类型的4CL作用偏离木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成。　　 利用实时定量PCR考察4CL家族各基因在菘蓝不同器官组织中的表达情况，Ii4CL1在根中的表达水平最高;Ii4CL2在根中的表达水平最高;而Ii4CL3在花中的表达水平最高。三条基因均能响应甲基茉莉酸和紫外线诱导，表达量都有不同程度的提高。通过激光扫描共聚焦显微镜观察了Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3融合蛋白的亚细胞定位情况，均定位在胞质溶胶中。　　 经IPTG低温诱导后，分离纯化获得4CL家族各成员的蛋白，体外酶活测定相关酶动力学参数。结果表明，菘蓝中各4CL具有不同的底物选择性。Ii4CL2可与4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸催化结合，且催化能力均较强;Ii4CL3能与咖啡酸、阿魏酸催化结合， Ii4CL1与5种底物均不能催化结合。　　 以发根农杆菌C58C1为介导，成功建立了菘蓝发根培养体系;并且采取过量和抑制表达两种策略对菘蓝中4CL家族各成员进行转基因操作，通过对菘蓝野生型发根和抑制表达转基因事件的发根中落叶松脂素生物合成途径上的基因表达和目标化合物的积累水平进行分析。抑制表达Ii4CL1基因后，合成途径上基因的表达量有少量提高，同时，落叶松脂素的含量只有小幅度的无规则变化。抑制表达Ii4CL2基因后，转基因株系中4CL1的表达量有1.5倍左右的上调，4CL3的表达量大约是WT株系的2-3倍，PLR的表达量也有3倍左右幅度的上调。而3个株系中落叶松脂素的含量都有一定幅度的提高，最高含量是野生型的2.5倍。抑制表达Ii4CL3基因后，4CL1的表达量有2倍左右的上调，4CL2的表达量上升，大约是WT株系的5倍，PLR的表达量大约下调至WT株系的0.6倍。但是，落叶松脂素的含量有所降低，最低含量只有野生型含量的约0.4倍。综合以上结果初步判断，4CL3可能对落叶松脂素的合成途径起主要作用，4CL1几乎不起作用，4CL2是否起作用有待进一步研究验证。在此基础上，可以对抑制表达和过表达株系中苯丙素类生物合成途径上的所有关键基因表达量和中间过程产物含量进行全面考察，从而寻找更准确的功能区分证据，为整体调控和激活代谢流提供更为可靠的依据。