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猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是目前严重危害养猪业的两种病原,基因芯片检测技术具有高通量性、并行性、自动化等优点,本研究拟建立同步检测上述两种病原的基因芯片检测技术,为临床猪病诊断提供快速、高通量的检测技术。根据猪细小病毒VP2蛋白基因序列和副猪嗜血杆菌infB基因序列,利用Primer Premier 5.0软件分别设计两对不对称PCR引物。首先并利用伪狂犬病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒和猪瘟病毒4种病毒进行了PCR的特异性试验,利用猪链球菌2型、金色葡萄球菌、伤寒猪沙门氏菌和大肠杆菌4种病菌进行了副猪嗜血杆菌PCR的特异性试验,结果表明,两对引物高度特异,只有猪细小病毒和副猪嗜血杆菌检测为阳性,其余病原均为阴性。随后在PCR扩增最佳的条件下进行了3次重复试验,验证两对引物的重复性。在设计上述引物的基因序列处设计两条特异探针,对引物的下游5’端Cy3标记,探针5’端进行氨基化修饰,引物合成后用TE buffer稀释成10μM/L,探针稀释成5μM/L、10μM/L、15μM/L、20μM/L四个不同的浓度备用。按照预设的程序将不同浓度的探针进行点样,分别制备PPV与Hps基因芯片,以最佳浓度的探针制备PPV与Hps同步检测基因芯片,并用装有固定增效剂的湿盒固定探针;通过不对称PCR得到带荧光的PCR产物,将其变性并分别与基因芯片在不同的条件下杂交;杂交完成后,将芯片在预热后的洗涤液1、洗涤液2和洗涤液3中分别洗涤2 min;离心干燥后,用基因芯片扫描仪扫描芯片,观察并保存所获得的图片。在杂交过程中,以PPV为例,对靶探针长度、杂交湿度和温度等条件进行优化,结果表明基因芯片在杂交过程中,增长靶探针长度、增加杂交湿度有利于增强杂交信号,而PPV基因芯片在47℃时杂交信号最好,Hps基因芯片在49℃时杂交信号最好。在最优的杂交条件下制备、杂交PPV与Hps同步检测基因芯片,结果显示:不同浓度探针下的荧光信号无明显差别,杂交1h比杂交2h的杂交信号强。根据上述的杂交结果选用5μM/L浓度的PPV与Hps探针:制备同步检测基因芯片。结果显示:在48℃杂交1h的情况下,成功地同步检测到了PPV与Hps,且荧光信号清晰。最后,同批次点制的芯片在同样的条件下杂交3次,不同批次点制的芯片在同样条件下杂交3次,结果表明该基因芯片具有良好的重复性。将固定好的芯片4℃放置2个月,同样条件下杂交,扫描结果显示,荧光信号良好,说明该基因芯片具有良好的稳定性。总之,本研究初步建立了PPV与Hps基因芯片同步检测技术,达到检测病原的目的。为防控和消灭动物疫病奠定了基础,同时也为基因芯片技术诊断、研究动物疫情等提供了理论依据。