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1、背景周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)是Cdks家族成员之一,属于丝氨酸／苏氨酸激酶家族,由于Cdk5具有与其他Cdk成员同源序列而得名。其最早从哺乳动物脑中精制出来,并确定了很多特性。Cdk5单体形式没有激酶活性,只有与调节因子蛋白p35或p39结合才表现酶活性,p39和p35是Cdk5不可缺少的激活剂。在大鼠神经系统发育时期,p39和p35表现出不同的特点。在时间上,p39的表达总要比p35的表达迟一到二周；在空间上,p39主要表达于小脑,而p35主要表达在海马和初级嗅皮质。在神经元亚细胞结构上,p39表达于神经元的细胞体和轴突,而p35只表达神经元的细胞体,p35和p39在神经系统中的表达差别,提示p35和p39具有不同的作用机理。p39和p35的时空表达特点对于Cdk5/p35和Cdk5/p39调节神经元正常生长分化,迁移以及突触的形态和功能的整塑等具有不同的作用特点。当神经元开始极化时,Cdk5改变其亚细胞定位从细胞体到轴突,p35只表达神经元的细胞体,Cdk5/p35对于神经元的生长分化有着重要作用,而p39表达于神经元的轴突,表明Cdk5/p39对于晚期神经元轴突的生长分化有着重要的意义。树突棘是突触的重要结构,p35、p39均缺乏或Cdk5缺乏的海马神经元树突棘形态发育不全并且密度大大减少,而在p35缺乏的海马神经元,树突棘的发育形态正常而树突棘的突触活动能力明显减弱,表明了树突棘引起的突触活动主要依赖于Cdk5/p35的活性。在调节突触囊泡的分泌作用上,Cdk5/p35主要通过和神经突触前膜胞内蛋白-18(Munc-18)结合,并且磷酸化Munc-18,阻止Munc-18和突触融合蛋白1A (syntaxin 1A)的结合,促进囊泡的分泌,而Cdk5/p39主要通过磷酸化Munc-18促使囊泡外Ca离子内流,从而促进囊泡分泌。Cdk5/p35和Cdk5/p39的上述差别,表明了它们在调节神经系统的生长发育中有着不同作用。此外,Cdk5/p39相对于Cdk5/p35稳定性较弱,Triton X-100洗涤剂便可以将纯化的Cdk5/p39失活,而Cdk5/p35则不会。Cdk5/p39的复合物活性调节主要是依赖于Cdk5蛋白和p39蛋白的结合和解离,而Cdk5/p35的活性调节主要是依赖于p35蛋白的降解和合成。三叉神经痛(Trigeminal neuralgia, TN)是一种以慢性、阵发性的面部疼痛为特征的疾病,TN的发病机制仍不甚明了。三叉神经脊束核尾侧亚核(Spinal trigeminal caudal subnucleus, Vc)是外周伤害性信息向中枢传人的门户,是接受面口部伤害性刺激信息并将此信息向中枢传导的中继站。Vc内含有多种传递疼痛神经肽的阳性纤维末端,它们大部分来源于三叉神经节的神经元细胞,并且与Vc浅层内分布着大量的神经元的胞体和突起形成突触联系。近年来,我们和其他学者研究了Cdk5／p35对神经疼痛信号传递的调节作用。2006年,有学者用p35基因敲除模型p35-／-小鼠及p35过表达模型Tgp35小鼠,以野生型WT小鼠对照,发现Cdk5活性明显下降的p35-／-小鼠,对热刺激引起的疼痛反应也明显延迟；Cdk5水平明显上调的Tgp35小鼠,对热刺激引起的疼痛出现过敏反应。表明了Cdk5/p35参与了疼痛传递的调节作用。抑制Cdk5的活性已经成为治疗急、慢性疼痛的新靶点。综合以上研究背景,在本实验中检测了出生后大鼠各发育阶段Vc组织中p39和Cdk5的表达变化,并且检测了Cdk5/p39活性,通过本次实验结果和以往报道的出生后大鼠各发育阶段Vc组织中p35和Cdk5表达变化及Cdk5／p35活性进行了比较分析。2、目的检测出生后大鼠各发育阶段Vc组织中p39和Cdk5的表达及Cdk5的活性变化,通过实验结果分析比较不同发育期大鼠Vc内Cdk5的活性；分析比较p35和p39在空间和时间上的表达特点,为今后进一步研究在三叉神经痛模型中,Cdk5/p35或Cdk5/p39的表达变化及其意义打下良好的实验基础,以最终阐明三叉神经痛的发病机理为最终目的。3、材料与方法3.1实验动物分组SD雄性大鼠108只按发育阶段分为新生,一周,二周,三周,四周,成体各18只,每个发育阶段随机选取6只做Cdk5的Western bloting检测、6只做p39的Western bloting检测和6只大鼠做Cdk5免疫沉淀和蛋白活性分析,所有大鼠均由南方医科大学珠江医院动物实验室以常规固体饲料饲养,自由饮水,湿度40%-50%。3.2标本制备根据分组标志分别称取大鼠体重,按3ml／Kg体重腹腔注射水合氯醛麻醉后,根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱定好Vc坐标位置切取大鼠Vc组织块,分别放入相应标记好的试管,放入-80℃冰箱冻存。3.3 Vc组织抗原蛋白的提取按标记试管取出组织块,将其放入匀浆器内,加入细胞裂解缓冲液后,将匀浆器置于冰上进行彻底匀浆后,将匀浆液移至离心管后,在4℃下,12000rpm离心5min,提取其上清液装于已经标志好的离心管中,放入-20℃冰箱保存3.4 Vc组织上清液蛋白含量的测定。3.5根据测定的蛋白含量加样做Cdk5的Western bloting检测。3.6根据测定的蛋白含量加样做p39的Western bloting检测。3.7根据测定的蛋白含量加样做Cdk5的免疫沉淀和酶活性分析。4、结果4.1 Western blot检测Cdk5和p39蛋白的表达在大鼠出生后各发育阶段Vc组织中,p39表达变化显著,p39在新生大鼠的表达较弱,到一周后有所增加,三周时表达最高,这种水平持续到四周龄,在成体大鼠,p39的表达水平下降到与新生时的表达水平基本相当,而Cdk5的表达在整个发育阶段无明显的变化。4.2 Cdk5蛋白的免疫沉淀和酶活性分析的统计分析在大鼠出生后各发育阶段的Vc组织中,Cdk5活性呈现递减的曲线,在新生的大鼠Vc组织中,Cdk5的表达活性最高,从出生后的一周、二周、三周到四周逐渐递减,在成体大鼠,Cdk5的活性最低。新生大鼠的Cdk5活性约是成体的六倍。5、结论(1)在大鼠出生后各发育阶段Vc组织中,Cdk5的表达和Cdk5的活性变化无显著关系；(2)在大鼠出生后各发育阶段Vc组织中,p35和p39的表达有显著差异。p35表达在新出生、一周、二周最明显,而p39表达在二周、三周和四周最明显,p39的表达比p35的表达迟一周。(3)在出生后发育早期大鼠Vc组织中,Cdk5的活性变化与以往报道的p35的表达有密切的相关性,在出生后发育晚期大鼠Vc组织中,Cdk5的活性变化与p39的表达有密切的相关性。