背景目前越来越多的研究开始关注早期生命事件在人类晚期疾病风险产生中可能扮演的角色。2003年Barker提出了多哈理论。多哈(developmental origins of health and disease,DOHa D)即健康与疾病的发育起源,是近年来通过大量流行病学研究提出的关于人类疾病起源的新的医学概念。该理论表明人类在生命早期(胎儿期、婴儿期、儿童期)这一关键阶段经历任何一种不良因素暴露,都可能影响胎儿,婴幼儿的发育可塑性,带来表型特点的改变即组织和器官在结构与功能上会发生永久性或程序性改变,最终导致将来一系列儿童期,成年期疾病的发育源性改变,包括代谢性疾病,心血管疾病,癌症,出生缺陷,精神行为异常等慢性非传染性疾病(慢性病)的发生与发展。生命早期有4个时期可能是远期疾病起源的敏感窗口,分别是配子形成期,合子形成期,宫内发育期和青春发育期。在生命早期众多不良暴露中,烟草是常见及重要的不良暴露因素。流行病学结果表明,父亲受孕前长期吸烟或可导致男性后代出生后超重及肥胖。父亲吸烟可将慢性疾病遗传给下一代,后代出现内分泌紊乱,肥胖,患上代谢性疾病甚至心理障碍,癌症的发生概率可能也会增加。生命早期母本单方面孕期烟草暴露可导致孕期流产,围产儿死亡率增高,低出生体重儿、早产,胎儿宫内发育受限。女性孕期吸烟可导致后代出现超重甚至肥胖。一些动物实验发现围产期暴露尼古丁对子代糖尿病病理生理过程的重要途径造成破坏,包括减少胰岛β细胞体积和β细胞功能受损。生命早期父母本双重烟草暴露可能与儿童期超重风险增加密切相关。孕期父母同时吸烟的后代女性青春期和成年期的体重增加的风险上升。为了明确生命早期亲本烟草暴露引起子代胎源性代谢性疾病具体作用时期(配子形成期,合子形成期,宫内发育期),我们建立了生命早期亲本烟草暴露诱发后代胎源性糖尿病的动物模型,这给予了我们很多启示,无疑为探索后代慢性病的病因学及干预措施提供了一个新的窗口,为今后制定严格的控烟计划及大力倡导优生优育提供了理论依据。研究目的:根据人类的流行病学调查研究结果,利用C57亲本小鼠通过香烟烟雾浓缩物(CSC)饲喂建立生命早期烟草暴露诱发子代鼠糖尿病的动物模型,明确生命早期亲本烟草暴露对后代代谢性疾病的影响,确定生命早期烟草暴露发挥作用的敏感窗口时期。同时了解生命早期亲本烟草暴露对后代生长发育的影响。研究方法:1)父本C57小鼠CSC暴露处理(配子形成期):C57BL/6J野生型雄鼠从4周龄起,连续饲喂香烟烟雾浓缩物CSC(2mg/m L,隔天换一次)。即香烟烟雾浓缩物(CSC)父本暴露组;2)父本C57小鼠正常处理(配子形成期):另一组C57BL/6J野生型雄鼠从4周龄起正常饲养记为对照组。3)母本C57小鼠CSC暴露处理(宫内发育期):对2月-6月龄的C57BL/6J野生型雌鼠进行阴道涂片检测雌鼠发情周期中的发情期,雌鼠与CSC雄鼠/对照组雄鼠按1:1比例合笼。第二天阴道涂片查到阴道栓或阴道涂片发现雄鼠精子确定为受精,当日计为孕0.5天。从孕0.5天起,一组雌鼠连续饲喂CSC(2mg/m L,隔天换一次)至18.5天称重并取出单笼饲养。4)母本C57小鼠正常处理(宫内发育期)一组雌鼠见栓或查到精子后正常饲养至18.5天称重并取出单笼饲养。5)上述四组动物模型为:(1)♀╳♂;(2)♀CSC╳♂;(3)♀╳♂CSC;(4)♀CSC╳♂CSC;6)检测四组仔鼠血糖血脂相关指标:上述四组母鼠产下的仔鼠生长到4周及8周尾静脉取血行OGTT检测(检测血糖时间点为空腹,仔鼠腹腔注射实验剂量葡萄糖后第30min,60min,90min及120min血糖水平);四组仔鼠生长到第4周及第8周利用收集的血清进行血脂(总胆固醇及甘油三酯)的检测;四组仔鼠出生当日取下肢肌肉组织标本行病理组织切片查找脂肪细胞;7)上述四组仔鼠在出生后第4周及第8周取肠道粪便提取基因组总DNA进行16SV4微生物分析测序以了解各组微生物菌群与血糖血脂之间的关系。8)检测四组仔鼠生长发育指标记录上述四组孕14.5天胎鼠体重及形态发育;记录仔鼠出生时及出生后每周增重情况并绘制生长曲线至第8周。9)了解四组孕鼠妊娠过程及结局:记录妊娠期(孕0.5天至孕18.5天)四组母鼠体重增加情况;分娩时的窝胎数;分娩天数等。实验结果:1各组仔鼠代谢方面,我们分别在各组仔鼠相当于青春期及性成熟期的第4周及第8周检测了较为有代表性的代谢指标血糖及血脂。结果表明亲本双重烟草暴露组的仔鼠出现了在第4周及第8周出现了糖代谢异常,血糖水平明显升高,达到了糖尿病诊断标准[1]。血脂异常升高,达到了高脂血症的诊断标准[2]。值得注意的是,该组仔鼠同正常对照组仔鼠除出生当日外在生长发育的各个阶段,体重均有一定程度的增高。2在四组共计97例动物模型中,亲本双重烟草暴露组有5例,单纯母本孕期烟草暴露组及单纯父本孕前烟草暴露组分别发现了2例及3例新生鼠下肢肌肉脂肪异常沉积。3各组仔鼠出生后第4周肠道微生物:亲本双重烟草暴露组的仔鼠组拟杆菌门比厚壁菌门比例下降,在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例急剧下降,变形菌门(Proteobacteria)丰度增加,具有统计学差异的Biomarker也是变形菌门(Proteobacteria)。各组仔鼠出生后第8周肠道微生物:与4周仔鼠不同的是,同正常对照组相比,亲本双重烟草暴露组,单纯父本烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组Alpha多样性指数均是下降的,其中亲本双重烟草暴露组最为明显,这说明这三组物种的多样性是下降的,以亲本双重烟草暴露组为甚。4在四组雌鼠妊娠期间,我们也了解了四组雌鼠孕14.5天时胎鼠生长发育的情况。发现四组胎鼠在母鼠孕14.5天体重方面出现了差异,结果是同正常对照组相比,亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组的胎鼠体重明显下降,而单纯父本烟草暴露组同正常对照组相比未出现体重明显减轻的情况。相比正常对照组,亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组在仔鼠出生后第1周龄,第2周龄及第3周龄体重明显增大。而同正常对照组相比,单纯父本烟草暴露组仔鼠从第1周龄起至第6周龄体重明显减轻,差异有统计学意义,反映出受亲本烟草暴露的影响,各组仔鼠在从出生到出生后第8周各个阶段生长发育的不同变化。5在雌鼠妊娠期间,虽然亲本双重烟草暴露组雌鼠孕期增重的程度有所下降,产仔数量也略有减少,但这些变化并没有统计学意义,四组雌鼠妊娠期间体重增加及产仔数量基本接近。四组孕鼠在生产天数方面基本一致,均在正常生产期(19-21天)内生产,并未出现早产或过期产等异常情况。研究结论:1、宫内烟草暴露可以诱发成年期糖尿病;父本烟草暴露叠加后可以进一步诱发青少年期糖尿病。2、宫内烟草暴露导致子代青春期和成年期的糖脂代谢异常和肥胖相关的肠道微生物菌群发生改变,父本烟草暴露叠加后该类变化更为显著。3、亲本烟草暴露不影响孕期增重、产仔数、分娩期等妊娠基本指标,但是均会导致子代妊娠晚期和出生时体重显著性降低;同时宫内暴露的子代在幼年期和青春期有明显的生长追赶效应。4、亲本烟草暴露均对子代的糖脂代谢有不良影响,亲本双重暴露可能诱发子代胎源性糖尿病。