论文部分内容阅读
目的:研究铁过载对巨噬细胞及骨髓增生异常综合征(MDS)红系造血的影响及其作用机制。方法:(1)在培养巨噬细胞的过程中分别添加不同浓度(5、10、20、40、80μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)建立铁过载巨噬细胞模型(铁过载组),以不添加FAC作为对照组,应用可变铁池(LIP)检测证实细胞铁过载。检验这一过程中细胞数量及状态、细胞活性、细胞吞噬功能的变化,细胞生成活性氧(R OS)、活性氮(NOS)水平以及与之相关的氧化应激信号通路的变化。再用地拉罗司(DFX)去铁及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除过多的ROS后,检测上述指标的变化。(2)通过给予MDS小鼠的同窝野生型小鼠及MDS雄性小鼠腹腔注射右旋糖酐铁的方法建立小鼠慢性铁过载模型,实验分为4组,分别为对照组(Ctrl),铁过载组(IO),MDS组(MDS)及MDS+铁过载组(MDS+IO)。通过普鲁士蓝染色、肝脾指数、骨髓细胞LIP水平检测验证小鼠铁过载模型的建立,通过单侧骨髓单个核细胞(BMMNC)计数、骨髓造血祖细胞集落培养、骨髓红细胞不同分期比例检测证实铁过载对红系造血的损伤,通过检测红细胞ROS水平、NOX4及GPX1的m RNA表达水平、TGF-β家族成员的m R NA表达水平、血清转化生长因子11(GDF11)浓度,研究MDS铁过载损伤红系造血的机制。结果:(1)在培养液中加入不同浓度FAC培养,发现巨噬细胞内LIP水平升高,且具有浓度依赖性,在含80μmol/L FAC的培养液中LIP水平达到最高。(2)随着FAC浓度的提高,巨噬细胞的活性逐渐降低,依次为对照组的51.58%、40.98%、16.23%、3.46%、0.05%(均P<0.05)。选取活性降低至16.23%的FAC浓度(20μmol/L)作为后续实验铁过载组。(3)和对照组相比,铁过载组巨噬细胞的数量减少至对照组的32.80%(P<0.05),细胞状态由贴壁变为部分悬浮;铁过载组巨噬细胞的吞噬功能降低至对照组的20.40%(P<0.05)。(4)进一步的机制研究发现铁过载组的活性氧水平及活性氮水平分别是对照组的7.71及1.45倍(均P<0.05);经过荧光定量PCR检测发现,与对照组相比,参与活性氧生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)基因、参与活性氮生成的诱导型一氧化氮合酶(i NOS)基因的m RNA表达水平升高,参与活性氧清除的基因谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)m RNA表达水平降低;氧化应激信号通路相关的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)基因m RNA表达水平升高;负反馈调节氧化应激的叉头蛋白氧3(FOXO3)基因m RN A表达水平降低。(5)铁过载实验组进行去铁及抗氧化治疗后,上述损伤得到部分逆转。(6)成功建立铁过载小鼠模型:骨髓普鲁士蓝染色、骨髓细胞LIP水平检测证实铁过载模型建立。IO及MDS+IO组的肝脾指数相对对照组显著升高,进一步提示铁沉积。(7)BMMNC计数变化:和Ctrl组((30.06±1.76)*106)相比,IO组((29.40±1.74)*106)及MDS组((2.95±2.25)*106)右侧股骨BMMNC计数降低,但差异无统计学意义(P>0.05),MDS+IO组((19.12±5.18)*106)B MMNC计数降低,差异有统计学意义(P<0.05);与IO组及MDS组相比,MDS+IO组BMMNC计数明显降低(P<0.05)。(8)行集落分析发现:小鼠骨髓行集落培养结果显示,和Ctrl组相比,IO组、MDS组、MDS+IO组红细胞集落生成单位(CFU-E)、红细胞爆式集落形成单位(BFU-E)计数都减低(P<0.05);和IO组及MDS组相比,MDS+IO组两者计数也明显减低(P<0.05)。(9)骨髓红细胞不同分期比例变化:检测晚期红细胞比例发现,和Ctrl组(5.64±0.83)相比,IO组(4.04±0.49)、MDS组(3.46±0.31)、MDS+IO组(1.80±0.59)组都降低,差异有统计学意义(P<0.05);和IO组、MDS组相比,MDS+IO组的比例降低(P<0.05)。(10)晚期红细胞中ROS水平升高:骨髓晚期红细胞中,和Ctrl组(42994±3292)相比,IO组(54757±5982)、MDS组(65778±8186)、MDS+IO组(107757±6690)组ROS水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);和IO组及MD S组相比,MDS+IO组ROS水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(11)铁过载引起ROS相关基因表达改变:采用RT-PCR技术检测晚期红细胞中NOX4及GPX1的m RNA表达水平,结果发现,和对照组相比,在IO、MDS、MDS+IO组中NOX4表达水平以及和IO组、MDS组相比,MDS+I O组的NOX4表达水平得出和ROS水平相同的结论,而GPX1的表达水平与NOX4相反。(12)TGF-β家族成员的m RNA表达水平的变化:在晚期红细胞中,和对照组相比,IO组、MDS组、MDS+IO组GDF11、GDF15、Activin B、Acvr2b、ALK5的表达水平升高;与IO组及MDS组相比,MDS+IO组中其基因表达水平也明显升高。其中GDF11的表达水平改变最明显。IO组、MDS组、MDS+IO组GDF11的表达水平分别是对照组的3.56倍、3.89倍、5.24倍。(13)外周血清GDF11表达水平:和Ctrl组((342.0±26.09)pg/ml)相比,IO组((796.6±103.4)pg/ml)、MDS组((678.0±78.14)pg/ml)、MDS+IO组((1525.0±78.37)pg/ml)GDF11浓度升高(P<0.05);和IO、MDS组相比,MDS+IO组GDF11浓度升高(P<0.05)。结论:铁过载通过诱导氧化应激,激活氧化应激信号通路损伤巨噬细胞的数量及功能,通过诱导ROS水平升高及ROS介导的TGF-β家族水平升高,两者相互促进损伤MDS骨髓红系造血。本模型为深入研究铁过载对巨噬细胞及MDS红系造血的作用机制提供实验方法,并为治疗铁过载患者提供理论基础及寻找新的靶点。