[研究背景]骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是直接来源于骨骼系统的原发性恶性肿瘤,其特征是肿瘤细胞为未成熟骨或骨样组织。典型骨肉瘤是一种罕见的(占所有恶性肿瘤的0.2%)高度恶性肿瘤,估计每年每万人有3例发病。骨肉瘤主要在长骨发病,很少出现在软组织。相对应骨骼系统的快速发育期,其发病率达到顶峰。虽然现代的多模式治疗已经显著提高了肿瘤的可切除性和远期疗效,25-50%的病人初始没有转移,后续发生转移,这仍是造成病人死亡的主要原因。尽管采取积极的联合化疗和外科手术,仍有超过30%的病人发展为肺部转移。20世纪80年代新辅助化疗药物大大提高了骨肉瘤患者的5年生存率,然而此后无论在骨肉瘤患者的治疗升级还是预后改善等方面未再有新的研究进展。在骨肉瘤患者发生肺部及其它部位远隔转移后,其长期生存率仍较低,仅为10-30%。目前大剂量应用的常规化疗药物副作用大,因此,新的治疗目标应着重于探索寻找安全有效的化疗药物。值得注意的是,癌症患者的数量和治疗成本不断增加,这对政府来说成为一项巨大的财务负担。在发达国家的抗癌治疗的费用是螺旋式增长的,其对经济影响正日益成为与国家卫生服务密切相关的事件。国家公共卫生系统急需新的既有效而且价格低廉的抗癌策略。在这方面,探寻针对肿瘤治疗的药物“重用”,也就是用现有药物寻找新的治疗适应症,将是一种高效、现实和便宜的策略。基因的扩增、缺失、移位及其他突变将会引起肿瘤的发生,基因组不稳定性所引起的骨组织的增殖和分化异常,将会导致骨肉瘤的发生。研究证实基因组突变在骨肉瘤的发生中起着重要的作用。包括DNA甲基化在内的众多表观遗传学改变也被证实在肿瘤的发生发展中扮演重要角色,骨肉瘤也不除外。研究证实DNA甲基化在多种恶性肿瘤的发生和发展中作用尤其重要。癌症的发生存在相关基因的变化,这些变化主要为癌基因的低甲基化状态和抑癌基因的甲基化程度升高。OS的特征是频繁的基因组不稳定性、高度异质核型、基因表达的变化和复发性表观遗传改变。在骨肉瘤的多项研究中,基因甲基化水平的变化与骨肉瘤的临床分期、外科分级、转移及预后等临床指标关系密切。S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine,SAM)是多种生化反应的甲基供体,它对甲基化的调控主要是通过抑制DNA去甲基化的过程并导致促癌基因去甲基化和沉默来实现的。据报道,SAM有抗癌的特性,在多种癌细胞中发挥抗增殖作用,可以作为抗癌药物应用。在骨肉瘤的相关研究中,SAM主要是通过阻滞细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑制骨肉瘤细胞增殖的作用。然而其分子机制的研究才刚刚开始。SAM在肿瘤治疗的优势在于它是天然存在的分子,在人体内通过甲硫氨酸腺苷转移酶同工酶合成,并且是FDA批准的营养补充剂,价格低廉,非常安全。Sox2是属于高迁移率族蛋白(High mobility group protein,HMG)家族的核转录因子,其在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新中起决定性作用。Sox2也是骨肉瘤细胞保持干细胞特征的关键因素。研究发现,人和小鼠骨肉瘤细胞株显示高表达的Sox2,通过内源性Sox2基因敲除或RNA干扰Sox2基因表达,骨肉瘤细胞侵袭和转移体外明显减少。这意味着Sox2具有促进骨肉瘤发生和转移的作用。Wnt信号通路通过β-catenin与Tcf/Lef家族的结合调节基因转录,β-catenin在细胞质内的稳定性是Wnt信号通路发挥作用的核心因素。当细胞内β-catenin蛋白水平降低时,Wnt通路闭合;当β-catenin蛋白水平升高时,Wnt通路开放。Wnt/β-catenin信号通路在骨细胞的成骨和分化中起着重要作用。在肿瘤发生、发展的机制中Wnt/β-catenin信号通路往往是激活的。研究表明Wnt/β-catenin信号通路的激活促进成骨细胞过度增殖,并抑制破骨细胞导致骨肉瘤的发生。[研究目的]1、观察Sox2和β--catenin蛋白在人骨肉瘤组织中的表达,明确其与骨肉瘤病例临床特征的关系。2、观察SAM对骨肉瘤细胞活性的影响,分析SAM对Sox2及Wnt/β-catenin信号通路的调节作用,探索SAM抑制骨肉瘤细胞活性的作用机制。3、为SAM治疗骨肉瘤应用于临床提供理论参考和依据。[研究方法]根据研究目的,本实验分为以下三部分:1、通过免疫组织化学的方法研究人骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin的表达,分析骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin的表达与患者临床特征的关系,为两种蛋白在骨肉瘤发生和转移中的作用提供组织学证据。2、体外实验采用MTT法检测SAM对人类骨肉瘤U20S细胞的增殖影响。通过流式细胞术检测U20S细胞的凋亡情况。通过Caspase活性定量检测试剂盒检测Caspase-3,8,9的活性。细胞划痕实验用于检测骨肉瘤细胞的迁移。Western blot和实时荧光定量PCR检测Sox2,β-catenin和C-myc的表达。观察SAM对人骨肉瘤U20S细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响,探讨SAM在人骨肉瘤细胞中的作用机制。3、采用骨肉瘤K7M2细胞株建立裸鼠骨肉瘤模型,HE染色观察其组织学特点,观察SAM对动物模型肿瘤细胞增殖的影响并分析其安全性,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,Western blot和实时荧光定量PCR检测Sox2,β-catenin和C-myc的表达,体内实验探讨SAM可能的作用机制。[实验结果]1、骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin呈现为高表达(阳性率分别为80.77%和75.0%),与骨软骨瘤组织中两种蛋白的表达阳性率比较有显著性差异(P<0.05)。Sox2和β-catenin阳性表达率在不同的Enneking临床分期间比较有显著性差异(P<0.05)。Sox2和β-catenin的阳性率在发生转移(94.74%和78.95%)和未发生转移(72.73%和51.51%)组间比较差异有显著性(P<0.05)。而Sox2和β-catenin的蛋白表达水平与患者年龄、性别、病变部位以及病理分型均无明显相关性(P>0.05)。2、体外实验结果表明,随着SAM剂量(50,100,200,400 μM)的增加、时间延长(24,48,72小时)实验组OD值与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。SAM可明显抑制U20S细胞增殖,具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪技术显示,200 uM的SAM作用于骨肉瘤的U20S细胞24和48,随着时间延长,早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐升高(P<0.05),处理48小时的U20S细胞凋亡率明显高于处理24小时的,所以SAM可以诱导人骨肉瘤U20S细胞的凋亡,并且存在时间依赖性。在划痕实验中SAM处理48小时,与对照组相比,随着SAM(50、100、200、400 μM)浓度的增加,实验组细胞划痕之间的距离显著增加(P<0.01),说明SAM显着降低了 U20S骨肉瘤细胞的迁移能力。Caspase活性检测结果显示:50、100 μ M的SAM作用于U20S细胞24小时、48小时,Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9的活性相对于对照组没有明显的增强(P>0.05),三种酶的活性随时间和药物浓度的变化无明显的增加。200 μM的SAM作用于人骨肉瘤U20S细胞24小时,与对照组相比,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性显著升高(P<0.05),同剂量下48小时与24小时相比酶的活性没有显著升高(P>0.05)。400μM的SAM作用于U20S细胞24小时,其Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9的活性相对于对照组及200 uM组有明显的增强(P<0.05),药物作用48小时与24小时相比酶活性无显著升高(P>0.05)。在200 u M的SAM作用48小时后对骨肉瘤U20S细胞采用Western blot和实时荧光定量PCR的方法检测Sox2、β-catenin及C-myc蛋白及mRNA表达的变化,与对照组相比实验组表达水平明显下降(P<0.05)。3、体内实验中,经大体外观及组织学检查证实K7M2细胞成功建立裸鼠骨肉瘤模型。与对照组相比,SAM可明显抑制肿瘤生长。同时,裸鼠体重无明显下降,说明SAM具有明显的抗肿瘤效果和良好的安全性。SAM治疗组细胞凋亡蛋白Bcl-2表达下调,Bax呈现为高表达,与对照组相比差异显著,有统计学意义(P<0.05)。SAM治疗组Sox2、β-catenin和C-myc无论蛋白水平还是mRNA水平表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。表明SAM可能下调Sox2的表达并降低Wnt/β-catenin信号通路的活性起到治疗骨肉瘤的作用。[结论]1、人骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin表达升高,其表达水平与骨肉瘤的临床分期、远处转移有密切的关系。2、SAM可明显抑制骨肉瘤U20S细胞有的增殖、迁移。通过增强Caspase-3,8,9的活性起到诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。3、SAM治疗骨肉瘤的机制可能与其下调Sox2的表达、降低Wnt/β-catenin信号通路的活性有关。4、SAM为骨肉瘤的治疗提供了新的思路和方法。