【摘 要】
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目的MicroRNA(miRNA)是由内源基因编码且长度在22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子,它们在细胞中具有许多重要的调节作用。一个miRNA可以作用于多个靶基因以及多个miRNA可以
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目的MicroRNA(miRNA)是由内源基因编码且长度在22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子,它们在细胞中具有许多重要的调节作用。一个miRNA可以作用于多个靶基因以及多个miRNA可以作用于同一个靶基因这一特性使得关于miRNA功能的研究越来越受到重视。通过对TCGA数据库的挖掘,我们发现原发性结直肠癌组织当中部分miR-17/92簇的成员表达量显著高于它们在癌旁组织的表达量。进一步的生物信息学分析表明,miR-17/92簇可能通过抑制PTEN基因的表达来促进PI3K/AKT通路的激活来产生其致癌作用。本研究拟阐述miR-17/92簇参与结直肠癌细胞肝转移过程的具体调控机制。方法1通过生物信息学手段对TCGA数据库中结直肠癌病人的RNA-seq以及miRNA-seq进行联合分析,寻找在癌及癌旁组织中的差异表达miRNA和mRNA。利用UALCAN以及Starbase3.0等平台分析选定的miRNA和mRNA之间的相关性,预测miRNA的靶基因。2采用划痕实验实验、免疫印迹、荧光定量PCR来分别检测sw480、sw620、Hct116、DLD-1等结直肠癌细胞系的迁移能力,相关蛋白以及相关miRNA表达量,并计算miRNA与结直肠癌细胞系迁移能力的相关性。3采用transwell细胞转移实验来观察转染miRNA mimic后sw480细胞系体外转移能力。4采用荧光定量PCR、双荧光素酶报告实验来验证miR-17/92簇对其靶基因的作用。采用免疫印迹来检测转染miR-17/92簇后sw480细胞系内EMT相关蛋白的表达变化。5采用免疫荧光来观察转染miRNA mimic以后E-cadherin、β-catenin的细胞内定位的变化。采用免疫共沉淀来检测在sw480系内E-cadherin与β-catenin结合情况并采用Top-Flash实验来验证TCF/LEF-1活性。6采用脾脏注射sw480细胞的方式构筑小鼠肿瘤肝转移模型。成瘤后,实验组的sw480细胞系以尾静脉注射方式注射agomiR-19a-3p,观察结直肠癌细胞系肝转移的情况。结果1与癌旁组织和低转移性结直肠癌细胞株相比,miR-17/92簇在结直肠癌组织以及高转移性结直肠癌细胞株当中呈高表达。2 MiR-17-5p、miR-19a-3p、miR-92a-3p 可分别直接作用于 PTEN 基因mRNA3’UTR从而抑制PTEN基因的表达,进而影响PTEN/PI3K/AKT通路。3 AKT通路的激活通过影响经典的Wnt/β-catenin途径来促进核内细胞转移相关的转录因子的表达(比如C-myc、SNAIL),从而影响上皮细胞标志物E-cadherin的稳定性。结论与癌旁组织相比,miR-17/92簇在结直肠癌组织当中呈现出高表达,miR-17/92簇可以通过抑制PTEN基因的表达来激活PI3K/AKT通路进而调节Wnt/β-catenin通路以促进结直肠癌细胞系的EMT进程,最终增强其转移能力。
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