促进组织血管新生研究在整形外科、心脑血管缺血性疾病、肢体缺血疾病等领域有良好的应用前景,。本课题拟选择在整形外科领域中有代表性的带蒂皮瓣转移及游离脂肪组织移植进行促组织血管新生的研究。带蒂皮瓣转移后常见的并发症为皮瓣远端部分坏死,存活质量差,一直是整形外科难题之一。移植脂肪组织的存活率一般只有30%-70%,需要多次手术才能达到理想的充填效果,限制了其在临床的广泛应用。造成带蒂皮瓣转移后部分坏死及移植脂肪存活率低的主要原因是不能及时重建血运而缺血坏死。皮瓣转移后常见的并发症为部分目前许多学者认为血管新生的发生通过两种机制,即血管形成和血管生成。血管形成是微血管以出芽的方式从已存在的血管床长出形成新的血管分支及毛细血管丛;而血管生成是由EPC原位分化形成血管。进而提出了治疗性血管形成和治疗性血管生成两种治疗方法,前者主要是利用各种生长因子来调控成体中的血管形成;后者则是通过移植EPC或通过诱导、促进EPC动员、增生,使治疗局部的EPC数量增多,从而促进成体血管生成的治疗方法。应用VEGF基因治疗促进血管新生的研究目前已经取得了一定的进展,目前研究也表明bFGF和VEGF在促进组织血管形成作用方面有协同作用,联合应用时可明显增强疗效。本课题拟联合利用血管内皮祖细胞的治疗性血管生成作用,及VEGF和bFGF基因治疗的治疗性血管形成作用,以有广泛应用前景的游离脂肪移植和带蒂皮瓣转移为实验模型,促进有功能的血管大量新生,用游离脂肪组织移植和带蒂皮瓣转移动物模型来观察上述联合治疗方法早期及时重建血运的能力,同时初步探讨其血管新生的机制。通过一系列体外及动物模型体内实验研究,在动物模型上取得了良好的疗效,为进一步的临床应用研究奠定了基础。1.人脐血中血管内皮祖细胞的体外扩增和鉴定目的:探讨从人脐血中分离、培养、体外扩增EPC的方法,及体外进行EPC鉴定。方法:采用密度梯度离心法从脐血中分离EPC,体外分别培养在包被有FN和不包被FN的培养皿中,采用免疫组织化学技术及免疫荧光细胞染色技术鉴定培养贴壁细胞表面标志CD31、CD34、KDR及CD133的表达,透射电镜进行细胞的显微结构观察,流式细胞仪检测细胞表面标志CD133及表达CD133细胞比例。结果:包被FN的培养皿中细胞贴壁及增殖均比未包被的多,免疫组化染色CD31、CD34、KDR及CD133均呈阳性,培养当天的单核细胞和第4、7、10天的贴壁细胞CD133阳性细胞百分率分别为1.2%、21.3%、40.2%和1.0%。结论:脐血是EPC的重要来源,密度梯度离心法可用于体外分离脐血中EPC,FN有助于体外培养EPC的贴壁与生长。2. pcDNA3.1(-)/VEGF165的扩增、提取、纯化、鉴定及体外转染EPC目的体外扩增VEGF质粒,探讨脂质体介导VEGF基因转染EPC后的VEGF的表达,及其应用于基因治疗的可行性、安全性。方法真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165进行扩增、提取、纯化及鉴定,并在脂质体介导下转染EPC,转染后用免疫荧光细胞染色和ELISA检测EPC表达的VEGF,MTT法检测EPC对VEGF质粒转染的敏感性。结果质粒扩增后经鉴定VEGF基因序列正确,转染组的EPC与对照组相比,胞内表达VEGF明显增强,转染组培养上清中的VEGF表达量在转染的第1、4、7、14、21天分别为100±15、500±40、450±36、352±35及50±10 ng/L,且VEGF质粒转染对EPC增殖无影响。结论EPC可作为VEGF转染的靶细胞,体外转染后VEGF表达第4天达到高峰。3. bFGF真核表达质粒的构建及体外与VEGF基因共转染EPC目的克隆bFGF基因,并构建、扩增、提取、纯化及鉴定pcDNA3.1/bFGF质粒,以脂质体介导bFGF及VEGF基因体外转染EPC,观察转染bFGF基因单独转染、或与VEGF基因共转染EPC后bFGF及VEGF的表达情况。方法从卵巢癌细胞系MA148提取总RNA,RT-PCR逆转录及扩增bFGF cDNA,克隆至pGEM-T-Easy质粒,然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,进行扩增、提取、纯化及鉴定,并在脂质体介导下单独转染、并与VEGF基因共转染EPC,转染后用免疫荧光细胞染色和ELISA方法分别检测EPC细胞及培养上清中bFGF和VEGF的表达,MTT检测EPC对bFGF质粒转染的敏感性。结果质粒扩增后经鉴定bFGF基因序列正确,转染后EPC对比对照组胞内表达bFGF明显增强,转染组培养上清中的bFGF表达量在转染的第1、4、7、14、21天分别为60±15、360±20、280±17、162±13及20±5 ng/L,且bFGF质粒转染对EPC增殖无影响。VEGF与bFGF基因共转染EPC后VEGF与bFGF的表达规律与单个基因转染基本相同。结论本实验克隆了bFGF基因,构建了的pcDNA3.1/bFGF质粒,质粒单独转染或与VEGF基因体外共转染EPC,转染后bFGF和VEGF表达均在第4天达到高峰。4.缺血皮瓣的内源性VEGF、bFGF及VEGFR-2表达目的研究缺血皮瓣的内源性VEGF、bFGF及VEGFR-2表达的动态变化,为外源性VEGF、bFGF治疗缺血皮瓣提供理论依据。方法制备裸鼠的缺血皮瓣模型,通过免疫组织化学染色和RT-PCR两种方法,分别从生长因子的蛋白水平及mRNA水平探讨缺血皮瓣组织术后的内源性VEGF及bFGF的变化情况,并应用RT-PCR探讨了VEGFR-2变化情况。结果缺血皮瓣的平均存活率为68.2%,皮瓣的中点和末端处的VEGF、bFGF及VEGFR-2 mRNA均在术后开始上升,中点和末端处的VEGF、中点处bFGF mRNA均在术后24h达到高峰,中点和末端处的VEGFR-2、末端处的bFGF mRNA均在术后12h达到高峰,然后逐渐下降。皮瓣末端的VEGF、bFGF mRNA水平明显较中点低,而术后12h、24h及4d时皮瓣末端的VEGFR-2 mRNA水平高于中点处。结论缺血皮瓣术后皮瓣末端内源性VEGF、bFGF等生长因子的不足可能是皮瓣末端坏死的原因之一,VEGFR-2表达的变化说明在皮瓣术后4d内补充外源性VEGF因子可能是较佳时机。5. VEGF、bFGF基因共转染EPC移植促进缺血皮瓣存活目的探讨VEGF165、bFGF基因共转染EPC移植促进缺血皮瓣的血管新生,提高皮瓣存活率。方法利用脂质体介导VEGF165、bFGF基因体外共转染EPC,然后移植于裸鼠缺血皮瓣,皮瓣早期断蒂,观察皮瓣的微循环血流灌注、血管密度、存活率、EPC移植后体内观察VEGF、bFGF表达等指标。结果VEGF165、bFGF双基因转染EPC、VEGF165单基因转染、bFGF单基因转染、单纯的EPC移植裸鼠缺血皮瓣后,以及对照组的皮瓣存活率分别为99.5%±2.9%、97.2%±2.8%、78.5%±2.0%、60.3%±2.1%、34.2%±1.8%。双基因转染EPC后移植体内检测均有VEGF、bFGF蛋白的表达上升,转染VEGF165组、转染bFGF基因组及共转染组,VEGF及bFGF蛋白分泌均在第7d达到高峰,随即逐渐下降,至第28d时降到较低水平。术后第7d时五组皮瓣中点处的毛细血管密度分别为(78.4±7.2)个/ mm~2、(57.5±6.1)个/ mm~2、(39.8±6.1)个/ mm~2、(33.5±3.2)个/ mm~2、(15.2±1.6)个/ mm~2;第11d时毛细血管密度分别为(95.2±7.3)个/ mm~2、(74.2±6.9)个/ mm~2、(65.1±6.4)个/ mm~2、(50.1±4.4)个/ mm~2、(25.7±2.9)个/ mm~2。结论脐血来源的EPC体外培养后移植体内可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率,而转染VEGF165、bFGF基因的EPC具有更强大的促血管新生的作用。6. VEGF、bFGF基因共转染EPC移植促进脂肪移植存活目的探讨VEGF165、bFGF基因共转染EPC移植促进游离移植的脂肪组织的血管新生,提高移植脂肪组织存活率。方法利用脂质体介导VEGF165、bFGF基因体外共转染EPC,然后与来自人体的脂肪组织混合移植于裸鼠背部,裸鼠随机分为五组:双基因转染EPC组、VEGF165单基因转染组、bFGF单基因转染组、单纯EPC移植组及对照组。结果五组的脂肪组织存活率分别为98.9%±9.9%、96.2%±8.6%、88.7%±4.0%、75.3%±6.8%、40.2%±2.5%。双基因转染EPC后移植体内检测均有VEGF、bFGF蛋白的表达上升,转染VEGF165组、转染bFGF基因组及共转染组,VEGF及bFGF蛋白分泌均在第7d达到高峰,随即逐渐下降,至第28d时降到较低水平。术后3个月时五组脂肪组织周边区的毛细血管密度分别为(121.4±10.4)个/mm2、(96.5±8.0)个/mm2、(94.8±7.1)个/mm2、(53.5±3.2)个/mm2、35.2±2.6个/mm2(P<0.05)。结论脐血中的EPC体外培养后移植体内可促进游离移植的脂肪组织的血管新生,提高存活率,而转染VEGF165、bFGF基因的EPC具有更强大的促血管新生的作用。