疟疾目前仍是严重危害人类健康的一种寄生虫病,每年导致100～300万人死亡。近年来,疟原虫抗药性和蚊媒耐药性的产生和迅速扩散,加之有效疟疾疫苗的缺乏,给疟疾防治工作带来很大的困难。传统方法已难于控制该病的流行,迫切需要为疟疾的防治工作提供新的方法和治疗靶点。通过对疟原虫在蚊体内发育过程中关键环节的干扰来阻断疟疾的传播,是控制疟疾的一类有价值的新策略。而这一策略的实施需要对蚊与疟原虫之间的复杂关系有着比较详细的了解,尤其是蚊抗疟原虫感染和疟原虫在蚊体内发育所需的一些关键分子的鉴定至关重要。抗菌肽的产生、细胞吞噬作用和黑化包被反应是蚊抗疟原虫感染中最为重要的三类免疫反应,对其相关分子的鉴定具有重要意义。其中,黑化包被反应是按蚊的一种有效的抗疟机制,反应的某些关键成分(如丝氨酸蛋白酶)来源于血淋巴。目前关于蚊抗疟原虫感染分子机制的研究主要集中于冈比亚按蚊,对大劣按蚊的研究甚少。大劣按蚊是我国及东南亚地区的主要传疟媒介,能够通过卵囊黑化包被的方式杀伤其体内的约氏疟原虫,从而阻断对该疟原虫的传播。因此,大劣按蚊-约氏疟原虫是一个很好的研究模型,利用该模型可以开展疟疾蚊媒阻断策略及医学昆虫免疫的相关研究。本研究即是利用二维电泳(Two Dimensional Electrophoresis,2DE)、原核表达、westernblot、RT-PCR、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、免疫组化、激光共聚焦等技术对大劣按蚊血淋巴中抗约氏疟原虫感染相关蛋白进行分离、鉴定,并对丝氨酸蛋白酶进行相关研究。整个研究分为三大部分:第一部分:筛选和鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴相关蛋白,并对该相关蛋白的生物学作用进行分析。1、利用2DE技术较好地分离了感染约氏疟原虫前后的血淋巴蛋白,比对后获得37个差异蛋白点。2、对感染前后的部分差异蛋白(DEP1～6)进行质谱分析,并对DEP1进行N端氨基酸测序,根据检测结果在蛋白质数据库中进行检索、分析和生物学特性的预测。结果显示,DEP1～6均为尚无研究的未知蛋白,其中DEP1可能在蚊抗疟原虫感染中起着重要作用。第二部分:对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)进行原核表达,并检测表达产物与烟草天蛾前酚氧化酶活化酶(PAP)抗血清之间的免疫反应性,同时进行生物信息学分析,以明确利用烟草天蛾PAP抗血清研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的可行性。随之,利用烟草天蛾PAP抗体,对电泳分离的血淋巴蛋白进行了鉴定和与疟原虫感染的相关性研究。1、成功构建了大劣按蚊丝氨酸蛋白酶Pinpoint/AdSP3表达质粒,并在JM109大肠杆菌中进行原核表达,表达获得了一35kDa大小的融合蛋白。Western blot检测结果显示,烟草天蛾PAP抗血清与大劣按蚊丝氨酸蛋白酶具有免疫反应性。对昆虫丝氨酸蛋白酶进行生物信息学分析显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与烟草天蛾PAP之间的氨基酸序列有较高同源性,且关键位点保守。本研究提示,利用烟草天蛾PAP抗血清识别大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可行。2、利用烟草天蛾PAP抗血清,结合SDS-PAGE、2DE和Western blot技术,对大劣按蚊感染约氏疟原虫前后血淋巴中的丝氨酸蛋白酶进行分离、识别和鉴定。结果显示,在大劣按蚊血淋巴蛋白中有分子量不同的两个蛋白能与PAP抗血清反应,且感染前后的差异提示该蛋白可能与疟原虫的感染相关。第三部分:从mRNA水平和蛋白水平分别对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行组织定位和定量研究。1、利用RT-PCR和Real-time PCR技术从mRNA水平对丝氨酸蛋白酶在蚊体内进行组织定位和定量研究。结果显示,血淋巴细胞和唾液腺中有丝氨酸蛋白酶AdSP3的表达,而蚊胃中则难以确定有无该酶的表达;感染前后及吸血后的不同时相点丝氨酸蛋白酶AdSP3的转录水平不同,其变化可能与疟原虫的感染有关。2、从蛋白水平利用免疫组化技术和激光共聚焦技术,确定丝氨酸蛋白酶在大劣按蚊不同组织中的分布及在感染前后不同时相点的蛋白含量。结果显示,在血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃中均有丝氨酸蛋白酶的蛋白分布;其含量于吸血后不同组及不同时相点有所不同,不同组间丝氨酸蛋白酶的蛋白水平变化提示该酶与疟原虫卵囊黑化包被反应相关。本研究旨在寻找大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关蛋白,并明确丝氨酸蛋白酶是否疟原虫感染相关蛋白,分析该酶在蚊抗疟原虫感染中的作用。结果显示,大劣按蚊丝氨酸蛋白酶可能参与了蚊抗疟原虫感染的卵囊黑化包被反应。这将为认识疟原虫和蚊媒的相互关系及进一步明确卵囊黑化机制、探索疟原虫防治新策略奠定试验和理论基础。