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第一部分红景天苷抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的作用目的:探讨红景天苷对骨肉瘤143B细胞增殖、侵袭和迁移能力的作用。方法:培养人143B骨肉瘤细胞系,采用30μmol/L和60μmol/L浓度的红景天苷处理骨肉瘤细胞,24,48,72h后,采用MTT实验检测细胞增殖能力,处理24小时后,采用Transwell检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR和蛋白印迹实验检测细胞MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达。结果:在处理24,48,72h后,采用MTT实验检测红景天苷对143B细胞增殖的作用。结果表明,处理24h后,60 μ mol/L组(0.038士0.002)和30 u mol/L 组(0.054±0.002)143B 细胞吸光度值低于对照组(0.074±0.004),t1=2.659,P=0.016;t2=1.993,P=0.039;处理 48h 后,60μmol/L 组(0.073±0.001)和 30 u mol/L 组(0.087±0.006)143B 细胞吸光度值低于对照组(0.105±0.007),t1=2.445,P=0.013;t2=1.659,P=0.041;处理 72h后,60μmol/L 组(0.106±0.043)和30μ mol/L组(0.144±0.036)143B细胞吸光度值低于对照组(0.187±0.023),t1=3.775,P=0.006;t2=2.036,P=0.01。因此,60μmol/L 和 30μmol/L 的红景天苷能够抑制骨肉瘤143B细胞的增殖能力,而且,随着处理时间的增加,其抑制作用更加明显,红景天苷抑制骨肉瘤143B细胞增殖能力可能具有时间依赖性。60 μ mol/L 红景天苷组(48.7±8.2)和 30μ mol/L 红景天苷组(76.8± 12.8)143B细胞跨膜数目均低于对照组(94.5±11.9),t1=8.056,P＜0.001;t2=2.472,P=0.038。60 μ mol/L红景天苷对143B的细胞抑制作用强于30 μ mol/L红景天苷,t=4.806,P=0.001。划痕实验用于测定红景天苷对143B骨肉瘤细胞的迁移能力的影响。对照组、30 μ mol/L红景天苷组、60 μ mol/L红景天苷组143B细胞的迁移率分别为98.7.0士0.3%、82.6±3.7%、52.9±6.8%,对照组比较,红景天苷(30和 60 μ mol/L))抑制了 143B 细胞迁移能力,t1=12.576,P＜0.001;t2=9.794,P<0.001。同时,60μmol/L红景天苷对143B的迁移抑制作用强于30μ mol/L红景天苷,t=7.654,P＜0.001。RT-PCR结果表明,60μmol/L(0.935±0.15)和30μmol/L(1.302±0.019)红景天苷处理组MMP-2mRNA相对表达量分别低于对照组(1.622±0.015),t1=11.478,P<0.001;t2=6.784,P=0.003。RT-PCR结果表明,60μ mol/L(0.686±0.007)和 30μ mol/L(0.791 ±0.016)红景天苷处理组MMP-9 mRNA相对表达量分别低于对照组(1.142±0.021),t1=7.556,P=0.002;t2=4.665,P=0.007。结果表明,60μmol/L(0.362±0.071)和 30μmol/L(0.553±0.112)红景天苷处理组MMP-2的蛋白相对表达量分别低于对照组(0.834±0.122),t1=9.698,P＜0.001;t2=3.129,P=0.013;60μ mol/L(0.135±0.021)和30μmol/L(0.31 ±0.05)红景天苷处理组MMP-9的蛋白相对表达量分别低于对照组(0.42±0.08),t1=6.447,P=0.006;t2=3.029,P=0.015。结论:红景天苷能抑制骨肉瘤增殖、侵袭转移,其机制与MMPs基因相关。第二部分红景天苷介导自噬抑制骨肉瘤细胞侵袭、迁移的机制研究目的:探讨自噬在红景天苷抑制骨肉瘤侵袭转移中的作用和关键机制。方法:取人骨肉瘤细胞系143B,取60μmol/L红景天苷处理骨肉瘤143B细胞24小时,然后在透射电子显微镜下观察细胞自噬。采用60 μ mol/L和30 μ mol/L的红景天苷处理骨肉瘤143B细胞24小时后,Western-blotting实验检测各组细胞LC3、Beclin-1蛋白表达水平变化。为进一步研究红景天苷抑制骨肉瘤增殖、侵袭的作用是否与自噬有关,本实验培养骨肉瘤143B细胞,实验分组:60μ mol/L红景天苷(salidroside)处理组,60μmol/L红景天苷+3-MA(自噬抑制剂)处理组,对照组,3-MA处理组。处理24、48和72小时后,采用MTT法检测各组细胞增殖,取处理24小时后143B细胞,采用Transwell法检测各组细胞侵袭能力,采用Western-blotting实验检测各组细胞LC3II、MMP-2蛋白表达水平变化。结果:60μmol/L红景天苷实验组自噬体形成数目(2.6±0.5)多于对照组(1.3±0.4),P<0.05。60μmol/L 和 30 μ mol/L 的红景天苷处理组 LC3、Beclin-1蛋白表达水平均高于对照组,均差异有统计学意义,而且60 μmol/L红景天苷处理组骨肉瘤143B细胞的LC3、Beclin-1蛋白表达水平高于30μ mol/L的红景天苷处理组,差异有统计学意义。LC3II/LC3I比也是观察细胞自噬活性的重要指标之一,LC3II/LC3I逐渐增加,表明自噬现象更加活跃。本实验结果表明,60μmol/L和30μmol/L的红景天苷处理组LC3II/LC3I比均高于对照组,均差异有统计学意义,而且60μ mol/L红景天苷处理组骨肉瘤143B细胞的LC3II/LC3I比高于30μ mol/L的红景天苷处理组,差异有统计学意义。60μ mol/L红景天苷+3-MA(自噬抑制剂)处理组143B细胞在24、48和72小时的细胞增殖能力高于60μmol/L红景天苷(salidroside)处理组,3-MA处理组在24、48和72小时的细胞增殖能力高于对照组。60 μ mol/L红景天苷+3-MA处理组143B细胞侵袭能力高于60 μ mol/L红景天苷处理组,3-MA处理组在细胞侵袭能力高于对照组。Western-blotting实验检测结果表明,60μmol/L红景天苷+3-MA处理组MMP-2蛋白表达水平高于60 μ mol/L红景天苷处理组,60 μ mol/L红景天苷+3-MA处理组LC3II蛋白表达水平低于60 μ mol/L红景天苷处理组。结论:红景天苷能激活骨肉瘤细胞143B的自噬,自噬抑制剂3-MA部分逆转了红景天苷对骨肉瘤143B细胞增殖和侵袭能力的抑制作用,红景天苷可能通过激活自噬发挥抑制骨肉瘤侵袭转移的作用。