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【目的】体外培养人脑胶质瘤细胞,从中分离鉴定胶质瘤干细胞样细胞;观察干细胞样细胞的生物学特性,如细胞周期、HLA-A和HLA-DR表达情况等;比较无血清培液中细胞获取的胶质瘤干细胞样抗原与有血清条件下培养细胞获得的非干细胞样抗原,以及CD133分选和X线辐照后细胞制备的抗原,致敏树突状细胞疫苗对胶质瘤的不同体外作用。【方法】用无血清培液(含EGF、FGF-2、B27)培养6例原代胶质瘤细胞和3例恶性胶质瘤细胞株;有限稀释法观察其增殖能力,用免疫组化观察血清诱导其多向分化,裸鼠脑内注射观察其致瘤性以鉴定肿瘤干细胞样细胞。继发肿瘤再次体外培养,观察形态学及生长特性,检测CD133+细胞比率,并用组织化学染色观察GFAP、P53等表达情况,与原发肿瘤比较。用流式细胞仪检测原代培养第0、3、7、28、60、90和120天时不同细胞的CD133阳性细胞比率;用无血清、血清培液分别培养长期培养的胶质瘤SHG62、SHG66细胞(原代建立,实验室长期培养传代,分别为WHOⅢ和Ⅳ级)以及U87和U251细胞株,观察胶质瘤中CD133+细胞在不同培液中的相互转换;无血清法和血清法培养SHG62、SHG66和U87细胞株,有限稀释法比较其克隆形成率,同时显微镜下通过形态学观察其分裂方式,细胞免疫化学染色检测CD133、Nestin及GFAP等蛋白表达情况;流式检测HLA-A、HLA-DR在两种细胞上的表达差异;流式分选获取CD133+细胞,用PI法检测其细胞周期,进一步了解两种培液中的细胞特性。分别从无血清、有血清培液的细胞以及免疫磁珠分选后的细胞用冻融法、6Gray X线辐照获取相应胶质瘤细胞抗原;分离出自体人外周血单核细胞分别用GM-CSF、IL-4体外诱导来获取树突状细胞(DCs),与抗原孵育后再激活自体T淋巴细胞,制备效应细胞;流式细胞仪检测DCs致敏前后HLA-A、HLA-DR、CD80、CD86的变化以及非贴壁细胞中CD3+T细胞比例的变化,XTT法检测非贴壁淋巴细胞与DCs共培养后的增殖情况,同位素法检测效应细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用。2 Gray X线辐照胶质瘤细胞模拟放疗,分别将辐照前、后的胶质瘤细胞与相同抗原致敏的效应细胞共孵育,检测其杀伤率。【结果】胶质瘤在无血清培液中悬浮生长,该群细胞中50.3±2.63%的细胞能自我增殖,细胞免疫化学染色证实血清能诱导其多向分化,10~5,10~6,10~7细胞均能在裸鼠脑内成功致瘤,继发肿瘤再次培养形态学、生长特性、CD133+细胞比率同原发肿瘤,组织化学染色显示GFAP、P53等表达同原发肿瘤。CD133+细胞比率随着培养时间推移明显下降(P＜0.05);无血清培液培养的细胞中CD133+细胞比率明显高于血清培液培养者(P＜0.01);CD133+细胞可以在无血清培液和血清培液中互相转换。而无血清培液中的细胞较有血清培液中细胞具有更高的克隆形成率(P＜0.01),他们还高表达CD133、Nestin、HLA-A,低表达HLA-DR、CD80、CD86、GFAP等。此外,在增殖时发现两种分裂方式,其中以不对称分裂为主,细胞周期分析发现CD133+细胞更多地处在G0/G1期。无血清培液的细胞经免疫磁珠分选后,分别得到2.32±0.64%,5.37±0.82%的CD133+干细胞样细胞,利用上述细胞及有血清培液中的细胞分别制备不同的抗原。DCs经上述不同抗原刺激后HLA-A、HLA-DR、CD80、CD86明显增高(P＜0.01);非贴壁细胞与DCs共培养后细胞数目明显增多,T细胞比例明显增高(P＜0.01);无血清培液中干细胞样细胞制备的干细胞样抗原激活的效应细胞对肿瘤非干细胞样细胞和肿瘤干细胞样细胞杀伤率分别为70.2%±5.13%和56.7%±7.81%(P＜0.001),而非干细胞样抗原活化的效应细胞对非干细胞样细胞和干细胞样细胞的杀伤率分别为36.6%±6.45%和9.05%±3.49%(P＜0.001)。CD133分选后的细胞制备的干细胞样抗原随着CD133+比率的提高,相应效应细胞的杀伤能力也进一步提高,而6 Gray X线辐照能进一步提高其抗原性。相同抗原致敏的效应细胞对2 Gray X线辐照前、后的胶质瘤细胞的杀伤率无明显差异。【结论】无血清培液中的细胞具有干细胞样特征,CD133+细胞比率在原代培养过程中逐渐下降,而无血清培液能明显提高CD133+细胞比率,并且CD133+细胞可以在不同培液中相互转换,说明因子及微环境对干细胞样细胞的维持至关重要。胶质瘤细胞中存在不同亚群,不对称分裂是干细胞主要增殖方式,在干细胞和分化细胞之间可能存在按对称分裂方式增殖的“肿瘤祖细胞/前体细胞”,而肿瘤干细胞样细胞可分为静止群和活跃群,且静止群较多,这可能是干细胞难根治,易复发的原因之一。干细胞样细胞高表达HLA-A,低表达HLA-DR,HLA-DR缺失可能是干细胞免疫逃逸的途径之一,同时干细胞样细胞高表达CD133、Nestin,低表达CD80、CD86、GFAP等,在蛋白表达上有其独特性。胶质瘤干细胞样抗原较传统抗原有更强的免疫原性,CD133分选后获取的抗原负载的效应细胞杀伤能力更强,X线辐照能进一步提高其抗原性。而干细胞样细胞同时具有更强的免疫逃逸能力。低剂量的X线辐照对免疫治疗无明显影响,这些为进一步提高临床DCs疫苗疗效提供了理论依据。【创新点】1、干细胞样细胞有其独特的特点,其相对高表达CD133、Nestin、HLA-A,低表达HLA-DR、CD80、CD86、GFAP等,CD133+细胞更多地处在G0/G1期;2、胶质瘤干细胞样抗原,尤其从CD133磁珠分选后的细胞中获取的抗原,较传统抗原有更强的免疫原性,X线辐照能进一步提高其抗原性(已申请专利);3、我们建立了两例恶性胶质瘤细胞系SHG62(WHOⅢ级)、SHG66(WHOⅣ级),长期传代性状稳定,细胞生长迅速。