论文部分内容阅读
目的:阐明柴朴汤可能通过下调14-3-3蛋白的表达,调控p38mapk信号通路,抑制eotaxin、TARC、IL-33 m RNA及蛋白的表达。方法:将实验用的24只Balb/c小鼠(4-6周),先进行为期1周的适应性喂养,通过随机数字表进行分组,包括正常组(A)、肝郁哮喘组(B)、柴朴汤组(C),每组各8只。第一阶段:A组小鼠正常饲养。在第1-28天时间段中,采取慢性不可预见性应激方式,对B、C组小鼠进行刺激,具体如下:禁食、禁水24小时,在4℃冷水条件下游泳5min,夹尾180s,与此同时,采取潮湿垫料、鼠笼倾斜等方式改变小鼠居住条件,详细记录小鼠每周末的体重增长量,以及强迫游泳的不动时间,评估肝郁型模型是否成功。第二阶段:在第1和第7天时,B、C组小鼠进行处理,条件为:10μg卵清白蛋白(OVA)、400ug氢氧化铝混合液,选用腹腔注射。第14天的时候,在半封闭雾化箱中独立安置各组小鼠,选择1%OVA作雾化处理,以达到吸入激发哮喘表现的目的,1次/天,每次雾化时间为半个小时,一直持续7天。当小鼠表现出呼吸急促、口唇紫绀、发出哮鸣音时代表哮喘模型建立成功。A组小鼠均以等量生理盐水对照处理。特别注意的是,每组雾化前半小时的注胃处理不同,A、B组0.3ml生理盐水,C组0.3ml(1.5g/kg)柴朴汤。最后一次给药1个小时之后,选择10%水合氯醛(400mg/kg)注射到各组小鼠腹腔内,以达到麻醉目的,然后通过其眼眶采取血样(需确保采血的无菌状态),在低温条件下放置1个小时,然后进行离心处理(4℃,2500r/min,25min),将血清分离出来,保存在-20℃条件下备用。将血清进行分组,标注为柴朴汤组含药血清、肝郁哮喘组血清与正常组血清。取小鼠肺组织行HE染色图像分析。以购买的小鼠气道上皮细胞进行培养,待细胞长至生长基质的70%~80%表面面积,予以传代。取生长良好的支气管上皮细胞(NHBEC)进行实验分组,共分3组:正常对照组(A)、肝郁哮喘血清组(B)、柴朴汤组(C)。A组为支气管上皮细胞+正常组血清2m L;B组为支气管上皮细胞+肝郁哮喘组血清2m L;C组为支气管上皮细胞+柴朴汤组含药血清2m L,各实验组血清均按20%浓度配置,每组添加等量的培养基。培养24小时,收集细胞培养液和细胞。采用活细胞跟踪分析显微镜影像分析系统观察细胞形态改变。用荧光实时定量聚合酶链反应(RTqPCR)检测小鼠气道上皮细胞中的14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33 m RNA表达。用免疫蛋白印迹法(WB)检测14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33的蛋白在小鼠气道上皮细胞中的表达。用酶联免疫法(ELISA)检测eotaxin、TARC、IL-33在小鼠气道上皮细胞培养上清液中的浓度。结果:1.肝郁造模情况:在造模前和造模第7天时,三组小鼠体重没有显著差异,而在干预后,肝郁哮喘组和柴朴汤组较正常组小鼠体重增长变慢(P<0.05);但肝郁哮喘组较柴朴汤组小鼠体重没有明显差异。在造模之前,正常组与肝郁哮喘组、柴朴汤组游泳不动时间变化不明显,造模结束前7天时,肝郁哮喘组和柴朴汤组较正常组不动时间增加(P<0.05),肝郁哮喘组较柴朴汤组小鼠游泳不动时间无明显差异。2.小鼠肺组织气道结构变化:A组小鼠肺组织气道结构正常,没有看到特殊改变,没有观察到明显的嗜酸性粒细胞或是其它炎症细胞在管壁有浸润的现象;在观察B组时,可见支气管管腔明显狭窄且边缘有增厚,甚至,有的部分出现了断裂情况。观察支气管管腔周围,可见炎症细胞浸润、支气管上皮细胞增生改变;C组小鼠肺组织未见明显的细胞增生,也没有看到有缺损,管壁基本是完整的,周围仅仅出现少量的炎症细胞。3.RT-qPCR检测:14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、IL-33的相对表达量在肝郁哮喘组明显高于正常组(P<0.01);14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、IL-33的相对表达量在柴朴汤组明显低于肝郁哮喘组(P<0.01)。TARC的相对表达量在肝郁哮喘组明显高于正常组(P<0.05);TARC的相对表达量在柴朴汤组明显低于肝郁哮喘组(P<0.05)。4.WB检测:14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33的蛋白表达量在肝郁哮喘组明显高于正常组(P<0.01);p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33的相对表达量在柴朴汤组明显低于肝郁哮喘组(P<0.01)。14-3-3蛋白的相对表达量在柴朴汤组明显低于肝郁哮喘组(P<0.05)。5.ELISA检测:eotaxin、IL-33的浓度在肝郁哮喘组明显高于正常组(P<0.01);TARC的浓度在肝郁哮喘组明显高于正常组(P<0.05);eotaxin、TARC、IL-33的浓度在柴朴汤组明显低于肝郁哮喘组(P<0.01)。结论:1.肝郁哮喘血清诱导小鼠气道上皮细胞表达14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33;2.柴朴汤含药血清可下调小鼠气道上皮细胞对14-3-3蛋白、p38mapk、eotaxin、TARC、IL-33的表达。