利用线粒体动力学相关蛋白探讨Sirt3基因敲除鼠心脏功能障碍的机制

来源 :吉林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ajimide001
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线粒体是维持心肌细胞功能最为关键的细胞器之一,通过调控细胞代谢、凋亡、氧化应激等维持细胞稳态,在心脏功能障碍等研究领域一直受到广泛关注。Sirt3作为线粒体基质中最为主要的去乙酰化蛋白酶,其调节代谢功能与抗氧化损伤的保护作用紧密相关。目前的研究认为,Sirt3参与了不同的心脏病理生理过程,但是其作用机制并不十分明确。现今已有的实验发现,Sirt3作为线粒体Sirtuins家族的一员通过调控抗氧化酶SOD2等的功能,被认为是一种抗氧化分子备受研究者的关注。线粒体的裂解和融合对于维持心肌细胞的健康和正常的功能是至关重要的。已经有研究证实,心脏线粒体过度融合或裂解,会使线粒体形态发生改变,进而引起心肌细胞的病理改变,最终影响心脏的整体功能,提示线粒体在应对氧化应激时,可能会改变其形态,甚至引起其动力学发生变化。此外,实验室前期研究发现,micro RNA-210(mi R-210)和氧化损伤密切相关,并通过影响线粒体功能调控能量代谢,但是否参与Sirt3对心脏功能和线粒体动力学的调控尚不清楚。因此,本研究以Sirt3基因敲除鼠为研究对象,着重从线粒体动力学角度,结合能量代谢等基本线粒体功能,探索了Sirt3通过影响线粒体动力学,进而导致心脏功能下降的机制,为临床缺血性心脏病的预防与治疗提供新的实验与理论依据。研究目的:通过探索氧化应激状态下心肌细胞能量代谢的改变及线粒体动力学改变,进一步分析相关蛋白的变化趋势,明确Sirt3功能下降导致心功能下降的机制。研究方法:1.利用构建的Sirt3基因敲除鼠模型,评估Sirt3缺失对小鼠心功能的影响;q PCR技术检测mi R-210表达水平;应用Western Blot技术检测线粒体动力相关蛋白的变化。2.应用H2O2构建H9C2细胞的氧化应激模型。应用CCK评估细胞活力,应用ATP试剂盒检测心肌细胞ATP改变,应用乳酸试剂盒检测乳酸含量变化,应用Mito-Tracker与Hoechst 33342共定位染色评估线粒体数量及形态改变和细胞存活状态,应用Western Blot检测线粒体动力相关蛋白水平变化。3.应用慢病毒转染构建mi R-210高表达的H9C2细胞模型,再次检测mi R-210预处理后的H9C2细胞中的ATP相对含量、乳酸含量;应用Mito-Tracker与Hoechst 33342共定位染色评估线粒体数量及形态改变和细胞存活状态;应用Western Blot检测线粒体动力相关蛋白水平变化。4.通过构建mi R-210低表达的H9C2细胞模型,检测mi R-210预处理后的H9C2细胞中的ATP相对含量、乳酸含量;应用Mito-Tracker与Hoechst 33342共定位染色评估线粒体数量及形态改变和细胞存活状态;应用Western Blot检测线粒体动力相关蛋白水平。结果:1.动物实验中发现Sirt3基因敲除鼠心脏射血分数下降、短轴缩短率进一步下降,表明小鼠心脏功能出现障碍;同时发现,mi R-210表达水平和Sirt3表达一致,都呈现下降的趋势;Sirt3基因敲除鼠心脏组织中,Sirt3、DRP1、OPA1、Fis1蛋白表达下降。2.氧化应激状态下,随着时间推移,细胞活力明显下降,H9C2细胞ATP产量明显下降,乳酸在1小时的时间点达到高峰,在这之后乳酸含量逐渐下降。而糖酵解抑制剂则使ATP产量进一步降低,乳酸的产量同样降低。氧化应激状态降低了Sirt3在H9C2细胞中的含量,而糖酵解抑制剂则进一步降低了细胞中Sirt3的含量。DRP1蛋白总量在氧化应激状态下呈现出增加的趋势,而磷酸化DRP1Ser637蛋白则表现出了下降的趋势。在氧化应激状态下,促进融合的OPA1水平呈下降趋势,线粒体裂解和丢失进一步加重。3.mi R-210干预H9C2细胞后,发现mi R-210高表达在一定程度上增加了H9C2细胞的能量供应。通过增加无氧代谢,在乳酸产量增加(糖酵解所致)的情况下,逆转H9C2细胞在氧化应激状态下ATP产量的减少。同时,mi R-210高表达逆转了氧化应激状态下线粒体的裂解和丢失。mi R-210高表达的H9C2细胞,氧化应激状态下,Sirt3水平与对照组相比无明显变化,但是高表达的mi R-210在一定程度上逆转了线粒体动力相关蛋白DRP1 Ser637磷酸化水平的下降,同时DRP1总蛋白仍呈上升趋势。在氧化应激状态下,促进融合的OPA1水平随着氧化应激呈下降趋势,mi R-210未能扭转OPA1的下降趋势。4.在氧化应激状态下,mi R-210过表达对细胞能量代谢有促进作用,而其低表达则加重了氧化应激对细胞能量代谢的损伤。在氧化应激状态下,mi R-210过表达对线粒体动力学的维持具有保护作用,而其低表达则加速了线粒体动力学的崩溃。在氧化应激状态下,mi R-210低表达使得DRP1蛋白总量进一步增加,但是DRP1 Ser637的磷酸化减少更为明显,而过表达的mi R-210则在一定程度上逆转了DRP1 Ser637磷酸化的减少。结论:1.Sirt3基因敲除鼠心脏射血分数、短轴缩短率下降,心功能下降等功能改变可能与线粒体动力学相关蛋白DRP1、Fis1、OPA1与mi R-210表达降低有关,提示mi R-210可能参与了Sirt3低表达诱导心脏功能障碍的活动。2.利用H2O2复制心肌细胞氧化应激模型,发现心肌细胞功能改变可能与线粒体动力学相关蛋白(DRP1、DRP1 Ser637、OPA1)变化有关,糖酵解通过Sirt3与线粒体动力学变化发挥了拮抗H2O2诱导H9C2细胞损伤作用,提示氧化应激通过糖酵解调控了ATP生成,从而诱导线粒体动力学发生改变。3.mi R-210过表达时Sirt3无明显变化,因此推测Sirt3可能作为mi R-210的上游,通过调控mi R-210调节细胞内能量代谢,进一步调控DRP1 Ser637磷酸化水平,最终调控线粒体动力学的变化。
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