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γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛存在于生物体内的非蛋白质氨基酸,在生物体生长发育过程中,参与抵御环境胁迫、调节激素信号,对动植物、微生物均具有重要的生理功能。植物体内的GABA主要是由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）脱羧生成。近年来,生产上主要关注如何改良加工方式以提高采摘后茶叶中GABA含量来制备“Gabaron”茶,对于茶树体内GABA代谢和调控模式的相关研究报道较少。本论文在前期研究获得了一条茶树GAD基因的基础上,继续挖掘茶树体内GAD基因家族的其他成员,克隆了2条谷氨酸脱羧酶基因,命名为CsGAD2、CsGAD3,并对它们的功能和表达特性进行了对比;同时施用不同外源激素,对模拟逆境胁迫下茶苗中CsGADs相对表达量进行分析;以及通过不同厌氧胁迫模式下离体叶片中CsGADs在转录水平和蛋白水平上表达量的测定分析,尝试从分子层面解析茶叶片富集GABA的机制,以期为改进栽培育种的方式和改良生产加工技术,提高茶叶中的GABA的含量提供理论支撑。主要内容如下:1.茶树GAD2和GAD3基因cDNA全长的克隆应用RACE-PCR技术获得CsGAD2的cDNA序列为1,872 bp,开放阅读框全长为1,539 bp,共编码512个氨基酸;CsGAD3的cDNA序列为1,833 bp,ORF框长1,482 bp,共编码493个氨基酸。生物信息学分析表明,CsGAD2、CsGAD3编码的蛋白分子量分别是58,027.0Da、55,757.20Da,都是细胞质蛋白,具有亲水性,不存在明显跨膜区域,二级结构中无规则卷曲是主要的结构元件。CsGAD2在C末端氨基酸序列与CsGAD1、CsGAD3不同,缺少色氨酸,推测CsGAD2可能不结合CaM。CsGADs与人参、葡萄、茄科植物亲缘关系较近。2.CsGAD2、CsGAD3基因组织表达特异性分析对CsGAD2、CsGAD3基因在茶树单芽、一芽、一叶、花蕾、成花和须根中的相对表达丰度进行实时定量PCR分析表明,CsGAD2基因的相对表达量在一叶中最高,成花中最低,其他组织表达量差异不明显。CsGAD3基因相对表达量在成花中较高,须根、一芽中表达水平相近,单芽、一叶、花蕾中表达量基本持平。3.CsGADs基因在不同激素处理下的相对表达测定对生长一致的“舒茶早”茶籽苗叶片分别喷施100μM ABA、100μM SA、100μM MeJA处理后,于不同时间点分别采集茶苗根、叶的样品,对CsGADs基因的表达情况进行荧光定量检测,结果表明CsGADs基因均能在ABA、SA、MeJA胁迫下诱导表达,其中ABA与SA胁迫诱导响应较为明显,MeJA胁迫诱导未达到显著差异,与CsGAD1启动子分析结果中包含的顺式作用元件功能相一致。4.茶树中GAD1的多克隆抗体的制备在前期实验克隆获得CsGAD1基因基础上,构建重组质粒pET-28a-CsGAD1进行GAD蛋白的异源表达与纯化,以及GAD1蛋白的多克隆抗体制备。所得抗血清效价达到1:5000时是3.015,Western blot检测表明该抗体有良好的特异性。5.CsGADs在厌氧处理下的相对表达情况以及蛋白水平分析对“舒茶早”茶树叶片采摘后分别进行抽真空摊放、充CO2摊放、充N2摊放处理,以正常室温摊放作为对照,在不同时间点取样后,分别进行GABA含量测定和CsGADs基因的表达分析,HPLC测定GABA结果表明充CO2胁迫处理6h后积累的GABA达到最高值,接近初始值的12倍,根据CsGADs基因的荧光定量PCR分析表明,CsGADs基因在逆境二氧化碳、氮气、真空处理下均被诱导表达,但基因家族成员间响应不同胁迫的模式并不一致,CsGAD1在0.5h对充CO2的响应达到最高值,而翻译水平的测定表明,CsGAD1蛋白的表达具有滞后性。