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研究背景和目的:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是一种恶性浆细胞增殖性疾病,为第二大常见的血液恶性肿瘤,多发于老年人。其临床症状主要有高钙血症,肾功能衰竭,贫血以及骨病变等[1]。尽管临床上已有硼替佐米、卡非佐米等化疗药的广泛使用,但同时也会出现MM的复发[21。因此,寻找有效调控MM发展的分子机制是目前亟待解决的问题之一。吡哆醇磷酸氧化酶（Pyridoxine-5’-phosphate oxidase,PNPO）是通过临床数据库筛选出的与MM病人预后不良相关的基因,本研究旨在通过体内外实验阐明PNPO对MM细胞的促增殖作用以及相关的具体分子机制,为MM临床诊断和治疗提供新的分子靶标。方法:1.运用MM数据库筛选出在MM中高表达的促癌基因PNPO,分析该基因与MM患者预后不良以及生存率的关系。2.通过蛋白免疫印迹法（Western blot WB）分别在MM细胞株H929、ARP1、XG1、OCI、CAG中验证PNPO的蛋白表达水平;使用PNPO-cDNA或shRNA质粒进行慢病毒包装,并将慢病毒转染ARP1与CAG细胞,随后使用嘌呤霉素（puromycin）筛选出稳定的PNPO过表达（PNPOOE）或敲低（PNPOKD）的MM细胞株;进一步通过WB证实PNPOOE或PNPOKD的细胞株构建情况。3.MTT法检测PNPOOE对MM细胞增殖的影响;细胞流式术检测PNPOOE对MM细胞周期的影响;WB检测PNPOOE细胞中Cyclin B1蛋白的表达。4.MTT法检测PNPOKD对MM细胞增殖的影响;细胞流式术检测PNPOKD对MM细胞凋亡的影响;WB 检测 PNPOKD细胞中 PARP、Cyclin B1、Caspase3、Cleaved Caspase3蛋白的表达。5.PNPOOE细胞和野生型（Wild type,WT）细胞同时进行转录组测序,并分析差异表达基因;通过WB检测PNPOOE或PNPOKD细胞中β-catenin、IL6、CDK14蛋白的表达;通过Wnt3a细胞因子刺激WT/PNPOKD的ARP1与CAG MM细胞,检测β-catenin蛋白的表达。6.通过免疫共沉淀富集ARP1 PNPOOE细胞中与PNPO结合的蛋白,然后通过SDS-PAGE电泳的方法将分离的胶条用考马斯亮蓝染液染色后洗脱,做蛋白质谱分析;运用免疫共沉淀验证PNPOOE细胞中PNPO与DVL3蛋白之间的相互作用及加入GSH后PNPO与DVL3蛋白之间相互作用的变化情况;将带有FLAG标签的PNPO质粒与带有HA标签的DVL3质粒在293T细胞中共同转染,然后用免疫共沉淀检测GSH加入细胞前后FLAG-PNPO与HA-DVL3蛋白之间的相互作用的改变情况。结果:1.数据库分析结果显示,在MM患者中,PNPO基因的表达显著高于意义未明单克隆免疫球蛋白血症患者（Monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS）和正常血浆（Normal plasma,NP）（P<0.05）;在 Assessment of Proteasome Inhibition for Extending Remission（APEX）临床试验结果中,高表达PNPO患者的生存率显著低于低表达的病人;同样地,Kaplan Meier生存分析结果显示,在Total Therapy2（TT2）中,高表达PNPO的患者生存率低于低表达的患者。2.WB实验证明PNPOOE的MM稳转细胞株构建成功。MTT实验结果显示,PNPOOE促进MM细胞的增殖;流式细胞术结果显示,PNPOOE显著增加了细胞G2/M期的比例,提示细胞增殖能力增加;WB实验结果显示,在PNPOOE的细胞中Cyclin B1的表达上调。3.WB实验证明PNPOKD的MM稳转细胞株构建成功。MTT实验结果显示,PNPOKD显著抑制MM细胞的增殖;流式细胞术显示,PNPOKD可促进MM细胞凋亡;WB进一步证明在PNPOKD的细胞中PARP的剪切体以及Cleaved Caspase3的表达上调,而Cyclin B1的表达下调。4.转录组测序数据分析获得3个差异表达的基因:TCF7L2,IL6和CDK14。WB实验结果表明PNPOOE或PNPOKD可提高或抑制β-catenin、IL6、CDK14的蛋白表达水平;此外,Wnt3a细胞因子的刺激可以上调PNPOOE细胞中β-catenin蛋白的表达。5.蛋白质谱结果显示与PNPO结合的蛋白有DVL3和Cyclin B1;其中质谱结果还提示DVL3蛋白中的甲硫氨酸被氧化;免疫共沉淀实验说明在PNPOOE细胞中PNPO与DVL3蛋白存在相互作用,在PNPOOE细胞中加入GSH后PNPO与DVL3蛋白之间的结合减少;将FLAG-PNPO质粒与HA-DVL3质粒在293T细胞中共转染后PNPO与DVL3间存在相互作用,加入GSH可有效减少PNPO与DVL3之间的相互作用。结论:PNPO基因的高表达与MM患者预后不良相关;PNPO过表达可以促进MM细胞增殖,并且促进MM细胞周期的发展;PNPO通过氧化DVL3蛋白促进MM细胞的增殖。PNPO可以作为MM临床诊断和治疗新的分子靶标。