卵泡的发育成熟是一个漫长的时期,始于始基卵泡,经历窦前卵泡、窦状卵泡和排卵前卵泡的发育过程。窦状卵泡颗粒细胞间积聚的卵泡液增加融合形成卵泡腔,卵泡腔内的卵泡液微环境对卵母细胞的后期发育及最后成熟起着至关重要的作用。颗粒细胞（GCs）是组成卵泡最大的细胞群,包括衬在卵泡壁上的壁层GCs（mGCs）和卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞（cGCs）。mGCs主要产生卵巢激素和分泌细胞因子,通过旁分泌和自分泌的形式调节卵母细胞发育;cGCs包绕在卵母细胞周围,cGCs的胞膜突起穿过透明带与卵子的胞膜形成缝隙连接,从而与卵母细胞形成紧密结合的合胞体,通过复杂的细胞间连接机制影响着卵泡的发育。线粒体是合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）,提供能量的主要场所。颗粒细胞内含有大量线粒体,卵母细胞生长发育所需要的能量也主要来自颗粒细胞的线粒体。因此,卵母细胞的发育、成熟、受精以及胚胎发育也依赖于线粒体的正常功能。氧化应激（Oxidative stress,OS）可通过脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤影响卵母细胞和胚胎质量以及胚胎植入,如果氧化应激反应过度,氧化损伤产物水平过高,就会抑制ATP酶的活性,损伤线粒体,减少卵泡发育的供能,从而降低卵母细胞的质量和胚胎发育潜能。子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）是生育年龄妇女最常见的疾病之一,绝大多EMs发生于盆腔,卵巢是最为常见的侵袭部位之一,其典型病变为异位内膜在卵巢皮质内生长、周期性出血,形成单个或多个囊肿,即卵巢子宫内膜异位囊肿（Ovarian endometriosis cyst,OEC）。已知多个、体积较大囊肿或OEC术后对卵巢皮质结构破坏明显,严重影响卵巢储备及卵母细胞发育,导致不良妊娠结局,但对于体积较小非手术的OEC患者卵巢储备功能及卵母细胞发育潜能是否同样受到影响,目前尚无定论。关于腹腔液和异位囊肿组织中氧化应激的研究有很多,但OEC患者卵泡液氧化应激标记物及其与卵母细胞发育潜能的研究鲜有报道。通过检测OEC患者卵泡液中氧化损伤标记物含量及其与卵母细胞发育潜能指标的相关性可以推测卵泡液中氧化应激高反应是卵母细胞发育、成熟及胚胎发育的不良影响因素。卵泡液也是颗粒细胞生存的微环境,因此我们推测卵泡液中氧化应激高反应引起颗粒细胞氧化损伤,从而导致线粒体结构改变、DNA受损、ATP产生减少可能是OEC患者卵母细胞发育潜能下降的机制之一。卵冠丘复合物体外培养过程中,线粒体功能障碍时,颗粒细胞会释放游离线粒体 DNA（Cyclic free mitochondrial DNA,cfmtDNA）到培养液中,因此我们提出假设卵泡液中cfmtDNA是线粒体功能不良的指标,OEC引起线粒体功能受损,从而引起卵泡液中cfmtDNA增加,进一步损伤颗粒细胞功能,导致卵母细胞发育潜能下降,卵泡液中cfmtDNA可作为预测卵母细胞发育潜能的一项检测指标。本研究分为两部分,第一部分对ART中OEC患者和输卵管因素不孕患者年龄、不孕年限、体重指数、bFSH、窦卵泡数、CA125、AMH、HCG日的激素水平（E2、P、LH）,获卵数、成熟卵数、成熟卵率、正常受精卵数、正常受精率、卵裂数、卵裂率、优胚数、优胚率、临床妊娠率及卵泡液中3-NT、8-OHdG、HNE、AOPP及SOD水平进行比较,分析卵泡液氧化应激对卵子发育、成熟、受精及早期胚胎发育的影响,提示OEC患者卵泡液氧化应激高反应是影响卵母细胞发育潜能的因素。第二部分通过观察和检测OEC患者壁层颗粒细胞中线粒体电镜超微结构改变、异常线粒体率、颗粒细胞中ATPase、IF1及OXPHOS复合物含量,研究OEC对壁层颗粒细胞线粒体功能的影响;通过检测卵泡液cfmtDNA、mGCs和cGCs中mtDNA含量变化及其与可移植胚胎率及优胚率的关系,研究OEC对颗粒细胞mtDNA的影响;通过分析卵泡液cfmtDNA与mGCs和cGCs中mtDNA相关性,提示卵泡液中cfmtDNA可作为预测卵母细胞及早期胚胎发育潜能的一项检测指标。第一部分 OEC患者卵泡液中氧化应激标记物与卵母细胞发育潜能相关性研究目的:通过检测OEC和单纯输卵管不孕患者卵泡液中氧化应激标记物含量,分析卵巢子宫内膜异位囊肿患者卵泡液微环境的氧化应激状态改变对卵子及早期胚胎发育的影响。方法:于2018年4月-2018年12月期间,选取IVF助孕且经多次B超检查诊断为单侧或双侧卵巢子宫内膜异位囊肿（OEC）（每侧OEC数目≤2个、OEC直径<4cm,部分行囊肿穿刺为巧克力液）患者30例,设为OEC组;选取同期单纯输卵管性不孕患者30例,设为对照组。记录两组患者的卵子及胚胎发育指标、临床妊娠率,ELISA方法检测卵泡液中氧化损伤标记物3-NT、8-OHdG、4-HNE、AOPP和抗氧化标记物SOD的含量。结果:1.患者一般病例资料特点患者年龄构成特点:OEC组平均年龄31.1±3.9岁;对照组平均年龄29.3±3.6岁。不孕年限两组分别为3.1±2.1年和3.1±2.2年,体重指数分别为22.5±3.0kg/m2和23.2±3.0kg/m2。上述三组数据两组之间无统计学差异。两组的AFC分别为10.4±4.4和11.6±3.5,基础FSH水平分别为5.7± 1.6mU/mL 和 5.1 ±1.8mU/mL,CA125 分别为 34.4±9.0IU/L 和29.9±8.6IU/L,AMH 分别为 2.5±0.9ng/mL 和 2.8±0.8ng/mL,Gn 用量分别为 2642.5±883.7IU 和 2495.5±729.9IU,Gn 天数分别为 12.1±2.3d 和11.8±2.4d,HCG 日的激素水平（E2、P、LH）OEC 组为 2951.6±1428.4pg/ml、1.2±1.0ng/mlL、1.1±0.9 mU/mL,对照组为 3541.9±1397.0 pg/ml、0.9±0.7 ng/mlL、0.8±0.5 mU/mL,两组间无统计学差异。子宫内膜厚度12.0±3.2mm和12.4±2.3mm,两组间无统计学差异,具有可对比性。2.卵母细胞及胚胎发育指标OEC组获卵数、成熟卵数、正常受精卵数、卵裂数、优胚数均低于对照组相应水平（P<0.05）;而两组间成熟卵率、正常受精率、卵裂率比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;OEC组优胚率、临床妊娠率均低于对照组（P<0.05）。3.氧化应激标记物检测两组间卵泡液中3-NT浓度比较,差异无统计学意义（P>0.05）。OEC组患者卵泡液中氧化损伤标记物水平,包括8-OHdG、4-HNE、AOPP浓度均高于对照组相应水平（P<0.05或P<0.01）。OEC组患者卵泡液中SOD浓度显著低于对照组水平,差异具有统计学意义（P<0.01）。小结:OEC患者优胚率和临床妊娠率均下降,卵泡液微环境存在氧化应激的过度表达可影响卵母细胞及早期胚胎发育潜能。第二部分 OEC患者颗粒细胞线粒体功能及卵泡液cfmtDNA与颗粒细胞mtDNA表达量的研究目的:通过检测壁层颗粒细胞中线粒体电镜超微结构改变、ATPase、IF1及OXPHOS复合物含量变化,分析卵巢子宫内膜异位囊肿壁层颗粒细胞线粒体功能改变;通过检测OEC患者卵泡液中cfmtDNA与mGCs、cGCs中mtDNA表达量及相关性,分析OEC患者卵泡液中cfmtDNA和颗粒细胞mtDNA含量变化及其与卵母细胞及早期胚胎发育潜能的关系。方法:留取第一部分实验入组患者的卵泡液中mGCs,透射电镜观察线粒体结构,qPCR方法检测ATPase、IF1含量,Western blot方法检测OXPHOS复合物含量;选取同期间因男方严重少弱精或既往IVF不受精史需要ICSI助孕的OEC不孕患者30例,设为OEC组,ICSI助孕伴或不伴输卵管因素患者30例,设为对照组。记录两组患者的卵子及胚胎发育指标,qPCR方法检测卵泡液中cfmtDNA、mGCs和cGCs中mtDNA表达量。结果:1.电镜超微结构及异常线粒体率电镜检测结果显示,与对照组患者比较,OEC不孕症患者mGCs中的线粒体数量明显减少,可看到大小、形状不同的线粒体,线粒体嵴扩张、嵴断裂部分融合、线粒体肿胀、形成空泡。通过对OEC不孕症患者、对照组患者mGCs中线粒体的电镜超微结构观察,结果显示,OEC组中异常线粒体率显著高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.ATPase、IF1 含量通过对OEC组患者和对照组患者mGCs中线粒体的ATPase、IF1水平检测,结果显示,OEC组mGCs线粒体的ATPase水平显著低于对照组,IF1水平显著高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。3.OXPHOS复合物含量OEC组mGCs线粒体OXPHOS复合物各组分中,ATP5A1、MTCO1、UQCRC2蛋白产物水平均低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）;两组间mGCs线粒体NDUFB8和SDHB蛋白产物水平比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4.ICSI患者一般病例资料特点患者年龄构成特点:OEC组24～36岁,平均30.6±3.5岁;对照组25～37岁,平均30.5±3.3岁。不孕年限两组分别为4.2±2.0年和4.1±1.8年,体重指数分别为23.1±3.0kg/m2和22.9±3.0kg/m2。上述数据两组之间无统计学差异。两组的AFC分别为9.4±3.7和10.2±4.3,bFSH水平两组分别为5.8±1.5mU/mL 和 5.6 ± 1.7mU/mL,CA125 分别为 35.3 ± 10.9IU/L 和30.2±9.0IU/L,AMH 分别为 2.3±1.0ng/mL 和 2.5±0.9ng/mL,Gn 用量分别为 2534.4±607.6IU 和 2360.4±626.8,Gn 天数分别为 11.7±2.6d 和 10.5±2.3d,HCG 日的激素水平（E2、P、LH）OEC 组为 3536.5± 1528.5pg/ml、1.1±0.5ng/mlL、1.2±0.6mU/mL,对照组为 3489.6±1469.3pg/ml、0.9±0.4ng/mlL、1.0±0.5mU/mL,两组间无统计学差异。子宫内膜厚度12.2±3.0 mm和12.5±2.8mm,两组间无统计学差异,具有可对比性。5.卵母细胞及胚胎发育指标OEC可移植胚胎数（率）、优胚数（率）均低于对照组相应水平（P<0.05）;而两组间组获卵数（率）、成熟卵数（率）、2PN数（率）、卵裂数（率）比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。6.卵泡液cfmtDNA表达量通过对OEC患者和对照组患者卵泡液cfmtDNA表达量检测,结果显示,OEC组卵泡液游离mtDNA表达量高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。7.壁层颗粒细胞mtDNA表达量通过对OEC患者和对照组患者mGCs中mtDNA表达量检测,结果显示,OEC组mGCs中mtDNA表达量低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。8.卵丘颗粒细胞mtDNA表达量通过对OEC患者和对照组患者cGCs中mtDNA表达量检测,结果显示,OEC组CCs中mtDNA表达量低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。9.卵泡液cfmtDNA表达量与颗粒细胞mtDNA表达量相关性分析将卵泡液cfmtDNA表达量与壁层颗粒细胞及卵丘颗粒细胞mtDNA表达量进行相关性分析显示,卵泡液cfmtDNA与壁层颗粒细胞及卵丘颗粒细胞mtDNA表达量均呈负相关（rs分别为-0.798和-0.690,P<0.01）小结:OEC患者mGCs线粒体存在结构和功能的变化,ATPase表达降低、IF1表达升高影响氧化磷酸化,导致OXPHOS复合物含量降低,影响对卵母细胞的供能,从而对卵母细胞及早期胚胎发育潜能产生不良影响。OEC患者卵泡液cfmtDNA表达量升高,mGCs及CCs中mtDNA表达量降低,可移植胚胎率及优胚率均下降,卵泡液cfmtDNA与壁层颗粒细胞及卵丘颗粒细胞mtDNA表达量均呈负相关,通过检测卵泡液cfmtDNA可间接预测卵母细胞及胚胎发育潜能。结论:1.OEC患者优胚率和临床妊娠率均下降,卵泡液微环境存在氧化应激的过度表达可影响卵母细胞及早期胚胎发育潜能。2.OEC患者壁层颗粒细胞线粒体存在结构和功能的变化,ATPase表达降低、IF1表达升高影响氧化磷酸化,导致OXPHOS复合物含量降低,影响对卵母细胞的供能,从而对卵母细胞及早期胚胎发育潜能产生不良影响。3.OEC患者卵泡液游离mtDNA表达量升高,壁层颗粒细胞及卵丘颗粒细胞mtDNA表达量降低,对可移植胚胎率及优胚率产生负性影响。4.卵泡液cfmtDNA与壁层颗粒细胞及卵丘颗粒细胞mtDNA表达量均呈负相关,提示卵泡液cfmtDNA可作为间接预测卵母细胞及胚胎发育潜能的指标。