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背景:细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)治疗作为生物治疗的一种广泛应用于恶性肿瘤的治疗中,在血液学恶性肿瘤治疗中CIK疗法副作用小,对复发难治血液疾病有效,能清除微小残留灶,延长患者生存期,是目前的研究热点,具有重要的临床研究价值。传统制备CIK的方法是将供者/患者外周血中的单个核细胞提取出来,体外用特定细胞因子刺激细胞增殖并在体外培养增殖,产生一群CD3+CD56+的淋巴细胞、CD3+CD8+的T淋巴细胞以及CD3-CD56+的NK细胞为主要效用细胞的异质性细胞群,称为细胞因子诱导的杀伤细胞。CD3+CD56+细胞是其中起主要作用的细胞。在传统CIK细胞的培养方法中,使用CD3单抗(CD3 monoclonal antibody,CD3 mAb)激活单个核细胞,Bonanno G报道,使用抗胸腺细胞球蛋白(Thymoglobulin,TG)激活淋巴细胞能更好的促进CD3+CD56+细胞的增殖,减少对调节性T淋巴细胞(Regulatory T cell,Treg)增殖的刺激。TG培养出的CIK细胞优于传统CD3-mab培养的CIK细胞。I.Popow和J.Leitner研究发现,TG中CD3抗体的浓度很低。Bonanno用TG培养CIK时添加的TG中CD3抗体的浓度并不足以导致CIK细胞的扩增,我们推测TG诱导的CIK的扩增有其他抗体的参与。CD2抗体为TG中另一个重要的抗体,其浓度远高于CD3抗体,CD2途径是另一个可促进淋巴细胞增殖的途径,推测TG促进淋巴细胞增殖依赖CD2途径,最终TG培养得到CIK表型及抗肿瘤细胞毒性的提升可能与CD2途径的淋巴细胞激活方式有关。抗人T细胞兔免疫球蛋白(ATG-Fresenius,ATG-F)是临床中另一种常用的抗T细胞多克隆球蛋白,ATG-F是用人Jurkat T淋巴细胞株免疫兔后制造的,I.Popow和J.Leitner的研究发现,ATG-F与直接用人胸腺细胞免疫兔后生产的TG抗体谱有很大的不同,虽然都有CD2抗体成分,但ATG-F几乎没有抗CD3效价,且具有较TG更高的抗CD28效价,CD28是免疫应答反应重要的共刺激分子,在淋巴细胞激活过程中有重要的作用。本实验将探究使用ATG-F通过CD2激活途径培养CIK的可能,并初步研究分析培养CIK所需ATG-F的适宜浓度及ATG-F培养的CIK与CD3单抗、CD3+CD28单抗、TG培养的CIK细胞的差异。目的:1.使用ATG-费森尤斯培养CIK,研究ATG-F培养CIK细胞的适宜浓度。2.比较ATG-费森尤斯培养的CIK细胞与其他抗体培养CIK细胞的增殖、表型、分泌能力及对肿瘤细胞杀伤能力的差异。方法:采集分离健康供者外周血单个核细胞(PBMC)培养CIK细胞,依照第1天添加抗体不同分别分CD3处理组、TG处理组、CD3+CD28处理组、ATG-F高剂量处理组、ATG-F中剂量处理组及ATG-F低剂量处理组,每3天补充含IL-2培养基,在第7天及第14天计数总细胞数量,并采集培养细胞流式分析CIK细胞群中各类细胞的比例及CIK细胞表面活化性受体分及抑制性受体分子的比例。14天时取不同培养组细胞洗涤重悬继续培养,36小时后取培养液上清。采用ELISA法测量细胞上清液中IFN-γ的浓度。在第14天时取CIK细胞以对K562靶细胞进行杀伤实验,钙黄绿素及碘化丙啶染色后使用流式细胞术分析死/活细胞比例,计算CIK细胞对K562细胞的细胞毒性。结果:1.第7天时ATG-F培养组增殖倍数均较低,在ATG-F处理组中增殖倍数最高为中剂量ATG-F处理组,少于常规CD3处理组,7天时增殖倍数最高为CD3+CD28处理组。在第14天时ATG-F处理组中增殖倍数最高的组为ATG-F高剂量处理组,显著高于ATG-F中剂量处理组及低剂量处理组(P<0.05)。增殖倍数最低为低剂量ATG-F处理组。增殖倍数最高为CD3+CD28组。14天时高剂量ATG-F处理组增殖倍数较TG处理组增殖倍数高(P<0.05),较常规CD3培养组无统计学差异(P>0.05),少于CD3+CD28培养组(P<0.05)。2.在第14天时ATG-F处理组中CD3+CD56+细胞比例最高为低剂量ATG-F处理组,但与高剂量ATG-F处理组无统计学差异(P>0.05)。高剂量ATG-F处理组CD3+CD56+细胞比例与CD3处理组无统计学差异。NK细胞比例最高为高剂量ATG-F处理组,高于CD3培养组(P<0.05)。使用高剂量ATG-F培养CIK在第14天时其活化受体CD314表达强于CD3处理组(P<0.05)。3.14天时ATG-F处理CIK组IFN-γ分泌能力都较CD3处理组强(P<0.05)。TG处理组IFN-γ分泌能力也较CD3处理组强。14天时靶效比为1:20对K562细胞4小时杀伤活性最高为中剂量ATG-F处理组,但其杀伤活性与ATG-F高剂量处理组无统计学差异。ATG-F高剂量处理组在靶效比1:5、1:10、1:20杀伤活性均显著优于CD3处理组(P<0.05)。结论:1.ATG-F能通过CD2途径激活并促进淋巴细胞增殖,可用以培养CIK细胞。ATG-F用以培养CIK细胞适宜浓度为500ng/ml。2.ATG-费森尤斯可代替CD3单克隆抗体用以培养CIK细胞,得到的CIK中具有更高的NK细胞比例,更高的活化受体的表达。ATG-F培养组CIK具有更高的对K562的细胞毒性,更强的IFN-γ分泌能力。3.ATG-费森尤斯为临床使用药物,使用ATG-费森尤斯培养获得的CIK性能更佳,ATG-费森尤斯有替代传统CD3单抗培养CIK用于临床的潜力。