全世界约1/3人口曾经或正存在乙型肝炎病毒的血清学表现，3.5-4亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者。乙型肝炎的疾病谱和自然史多种多样，从非活动性病毒携带状态至进行性加重不等，重者发展为肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。在亚洲，有40%的慢性乙型肝炎病人（chronic hepatitis B, CHB）死于肝硬化或肝细胞癌。乙型肝炎的遗传易感性和对治疗的应答体现在HBV与宿主基因组之间的长期共进化作用，这种进化是以人群中DNA分子的多态性为基础的。因此，运用遗传流行病学和分子流行病学的研究方法，确定和HBV感染后抗病毒治疗应答相关的易感基因和易感位点，对乙型肝炎个体化防治具有重要意义。白细胞介素28（IL-28）细胞因子,又称IFN-λ,分2个亚型，IL-28A和IL-28B，在抗病毒过程中起到免疫防御作用，P21活化蛋白激酶4（PAK4）位于IL-28B基因上游64kb处，属于P21活化蛋白激酶家族，Rac和Cdc42的效应蛋白。它是肌动蛋白细胞支架、神经轴突生长、细胞存活、激素信号系统和基因转录的重要调节器，PAK4特向作用于三磷酸鸟苷（GTP）形成GTP结合蛋白Cdc42Hs并且微弱作用于MAP激酶(mitogen-activatedprotein)的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)家族，参与丝状伪足形成的调节，在肌动蛋白细胞骨架重组中起着一定作用。前期全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）在美国、澳大利亚和日本分别证实分属IFN-λ家族的细胞因子IL28B附近的基因突变与丙型肝炎病毒感染后转归和治疗应答有关。IL28及其附近的PAK4基因多态性是否与中国汉族人群乙型肝炎病毒感染后抗病毒治疗应答有关目前很有争议。本研究拟采用分子流行病学病例对照研究设计，Hapmap数据库筛选出可能会影响HBV感染后抗病毒治疗应答的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism, SNP），基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS）技术对目标基因位点分型，分析基因型与慢性乙型肝炎的关系，探讨IL28、PAK4的基因多态性对中国汉族慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗应答的影响，以期为临床个体化治疗和预后提供依据。第一部分白细胞介素28基因多态性与慢性乙型肝炎病人拉米夫定治疗应答的关系目的：本研究选择白细胞介素28A基因（interleukin28A，IL28A，IFN-λ2）、白细胞介素28B基因（interleukin28B，IL28B，IFN-λ3）为候选基因，选取rs8099917和rs12980602两个位点分析宿主遗传因素与慢性乙型肝炎拉米夫定治疗应答的关系。方法：354例首次应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者作为研究对象，以调查问卷形式收集研究对象的基线资料、发病情况、检查结果，并在拉米夫定治疗1年时对病人的HBeAg血清转换情况、HBV DNA病毒载量及ALT复常情况进行跟踪随访。完全应答定义为HBe抗原转阴、HBVDNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；部分应答定义为HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；不符合上述标准者定义为非应答。利用CNKI和Pubmed查询免疫疾病易感基因和与治疗应答相关的文献，用Hapmap在中国汉族人群选择待研究基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）位点，Haploview软件排除呈高度连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的位点。收集外周血，采用血液基因组DNA提取试剂盒从抗凝全血提取DNA。运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted LaserDesorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）的实验平台对候选基因： IL28B-rs8099917（TT、 GT、 GG），IL28A-rs12980602（TT、CT、CC）进行DNA的SNPs分型。采用SPSS16.0进行数据处理和分析，对181例拉米夫定治疗应答组和173例非应答组计量资料两两比较用独立样本的t检验，单因素计数资料比较采用卡方检验，以非条件Logistic回归校正混杂因素并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence intervals，95%CI），以P<0.05为有统计学意义，统计检验均为双侧。结果：1位点连锁不平衡用Haploview软件证实rs8099917和rs12980602不存在连锁不平衡，选择的2个位点等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2应答组和非应答组患者基线特征的比较应答组中男性、吸烟和饮酒者所占的比例均低于非应答组（61.33%vs76.30%，P=0.002；29.83%vs43.35%，P=0.008；38.67%vs52.02%，P=0.012），证明性别、吸烟、饮酒是拉米夫定治疗应答的独立影响因素，男性患者、有吸烟饮酒史的患者更不容易实现治疗应答。年龄、HBV DNA和ALT水平在两组间均无统计学差异（50.86±11.03vs52.22±10.82；7.67log copies/ml vs7.69log copies/ml；279.50IU/L vs317.50IU/L；P＞0.05）。将纤维化程度分为f0-f4，与拉米夫定的治疗应答呈显著负相关，OR值为0.716(95%CI=0.432-0.986)，P=0.036，纤维化程度越高，治疗应答率越低。3rs8099917位点与拉米夫定治疗应答的关系对rs8099917基因位点检测结果发现，TT为其显性基因，无论在应答组还是非应答组未发现GG基因型，单因素分析应答组突变基因型GT携带率明显高于非应答组(8.8%vs2.3%)，OR值为4.097（95%CI=1.342-12.512, P=0.015）。在多因素分析中，当校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT基线水平后，IL-28B rs8099917位点的突变基因型GT仍显示与拉米夫定治疗的高应答有关，OR值为4.025(95%CI=1.316-12.354)，P=0.013。携带rs8099917GT基因型者可能预示着拉米夫定治疗的成功。4rs12980602位点与拉米夫定治疗应答的关系对rs12980602基因位点检测的结果与rs8099917相似，TT也是其显性基因。单因素分析应答组突变基因型CT和CC携带率明显高于非应答组（18.8%vs9.2%），OR值为2.27（95%CI=1.202-4.284）；P=0.014）。但在多因素分析中，当校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT基线水平后，IL-28B rs12980602位点的突变基因型CT和CC显示与拉米夫定治疗应答无相关性，OR值为1.765(95%CI=0.884-3.617, P=0.109)。结论：1用Haploview软件证实rs8099917位点和rs12980602位点不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2性别、吸烟、饮酒是拉米夫定治疗应答的独立影响因素，男性患者、有吸烟饮酒史的患者不容易实现治疗应答。3白细胞介素28基因的rs8099917和rs12980602两个位点基因多态性与HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人拉米夫定治疗应答有关联，携带rs8099917位点突变基因型GT，rs12980602位点突变基因型CT和CC者可能预示着拉米夫定治疗的成功，尤其以rs8099917位点突变基因型GT为生物学标志。4肝纤维化早期预示着对拉米夫定治疗的高应答。第二部分白细胞介素28、P21活化激酶4基因多态性与慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干扰素治疗应答的关系目的：聚乙二醇干扰素治疗费用昂贵且治疗有一定的副作用，所以高应答率病人的选择对临床合理用药来说非常必要。本研究选择IL28A（IFN-λ2）、IL28B（IFN-λ3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4基因（p21_activatedkinases4，PAK4）为候选基因，选取rs8099917、 rs12980602和rs9676717三个位点分析宿主遗传因素与慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素治疗应答的关系。方法：240例首次应用聚乙二醇干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者作为研究对象，以调查问卷形式收集研究对象的基线资料、发病情况、检查结果，并在聚乙二醇干扰素治疗6月时对病人的HBeAg血清转换情况、HBVDNA病毒载量及ALT复常情况进行跟踪随访。完全应答定义为HBe抗原转阴、HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；部分应答定义为HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；不符合上述标准者定义为非应答。利用CNKI和Pubmed查询免疫疾病易感基因和与治疗应答相关的文献，用Hapmap在中国汉族人群选择待研究基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）位点，Haploview软件排除呈高度连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的位点。收集外周血，采用血液基因组DNA提取试剂盒从抗凝全血提取DNA。运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted LaserDesorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）的实验平台对候选基因： IL28B-rs8099917（TT、 GT、 GG），IL28A-rs12980602（TT、CT、CC），PAK4-rs9676717（TT、 CT、CC）进行DNA的SNPs分型。采用SPSS16.0进行数据处理和分析，比较92例聚乙二醇干扰素治疗应答组和148例非应答组计量资料两两比较用独立样本的t检验，单因素计数资料比较采用卡方检验，以非条件Logistic回归校正混杂因素并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence intervals，95%CI），以P<0.05为有统计学意义，统计检验均为双侧。结果：1位点连锁不平衡用Haploview软件证实rs8099917、 rs12980602和rs9676717不存在连锁不平衡，选择的3个位点等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2应答组和非应答组患者基线特征的比较应答组饮酒者占36.96%，明显低于非应答组的50%（P=0.048），饮酒是聚乙二醇干扰素治疗应答的独立影响因素，有饮酒史的患者不容易实现治疗应答。年龄、男性所占比例、吸烟者所占比例、HBV DNA和ALT基线水平在两组间均无统计学差异（38.07±14.62vs37.3±12.67；67.39%vs66.22%；41.30%vs51.35%；7.67log copies/ml vs7.69log copies/ml；279.50IU/L vs317.50IU/L；P＞0.05）。3rs8099917位点与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs8099917基因位点检测结果表明，TT为其显性基因，应答组无GG基因型，应答组和非应答组TT、 GT和GG基因型的携带率无统计学差异(89.13%,10.87%,0.00%vs87.84%,9.46%,2.70%，P=0.838)。rs8099917位点与聚乙二醇干扰素治疗后6月的应答关联性分析结果表明，两者间没有明显的关联性，单因素分析OR值为0.881(95%CI=0.388-2.002)，P=0.838；多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，OR值为0.881(95%CI=0.388-2.002)，P=0.999。4rs12980602位点与与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs12980602位点检测的结果与rs8099917位点相似，TT也是其显性基因，应答组和非应答组TT、 CT和CC基因型的携带率无统计学差异(82.61%,15.22%,2.17%vs81.08%,18.92%,0.00%，P=0.186)。rs12980602位点与聚乙二醇干扰素治疗后6月的应答关联性分析结果表明，两者间没有明显的关联性，单因素分析OR值为0.902（95%CI=0.458-1.778），P=0.766；多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，OR值为0.688(95%CI=0.311-1.523)，P=0.356。5rs9676717位点与与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs9676717位点检测结果表明，应答组与非应答组TT、 CT和CC基因型的携带率有显著统计学差异（56.52%，32.61%，10.87%vs40.54%，52.70%，6.76%，P=0.009）。单因素分析rs9676717位点携带突变基因型CT+CC与干扰素治疗后的应答有显著的负相关性，OR值为0.524(95%CI=0.310-0.888)，P=0.016。当多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，PAK4基因的rs9676717位点的突变基因型CT+CC仍显示与干扰素治疗应答呈负相关， OR值为0.173(95%CI=0.037-0.799)；P=0.025。结论：1饮酒是聚乙二醇干扰素治疗应答的独立影响因素，有饮酒史的慢性乙型肝炎患者不容易实现治疗应答。2位于IL-28的rs8099917和rs12980602位点与慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干扰素治疗的应答率无关，而携带PAK4的突变基因型CT+CC降低干扰素治疗6月患者的应答。第三部分IL-28B基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除及干扰素治疗应答关系的Meta分析目的：采用Meta分析的方法，对国内外在不同人群不同类别乙型肝炎患者中开展的研究结果进行综合评价，评价IL-28B基因rs12979860位点及rs8099917位点与HBV感染后病毒自发清除及治疗应答的相关性。方法：利用关键词“IL-28B、SNP、hepatitis B、spontaneous clearance、treatment and interferon"联合检索PUBMED、 MEDLINE、 EMBASE、Cochrane library数据库、中国万方数据库、中文科技期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库的中英文文献。末次检索日期是2013年3月25日。共检索到32篇文献。由两位研究人员对检索到的所有文献题目和摘要进行评估筛选，最后选出5篇关于rs12979860位点与HBV感染后自发清除的相关文献、7篇关于rs12979860位点与HBV感染后干扰素治疗应答的文献、3篇关于rs8099917位点与HBV感染后自发清除的相关文献、3篇关于rs8099917位点与HBV感染后干扰素治疗应答的文献。纳入Meta分析提取纳入文献的信息如下：第一作者、出版年、研究设计类型、受试者来自的国家和种族、乙型肝炎诊断类型、病例组和对照组的定义和数量、提取DNA和分型的方法、病毒亚型、治疗方法等。文献未提供基因型的，利用相应的基因频率计算，分别提取rs12979860位点及rs8099917位点的相关数据，对两个位点的显性模型进行了Meta分析。计算优势比（OR）及其95%CI作为效应量。首先对纳入分析的原始文献进行Q检验，分析异质性，根据异质性检验结果，选择固定效应模型或随机效应模型求其效应合并值。用漏斗图和Begg’s检验进行发表偏倚分析，以P<0.05为差异有统计学意义。所有数据用STATA11.1分析。结果：1rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除的关系共有5篇符合分析条件的关于rs12979860位点与HBV感染后自发清除的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：各研究间不存在异质性(I2=20.0%，P=0.287)。根据异质性检验结果选择M-H固定效应模型对rs12979860位点显性模型（TC+CC vs CC）进行数据合并，结果显示，合并后的OR为1.05(95％CI：0.83-1.32，P=0.70)，证明rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除没有关联。Begg’s偏倚分析显示无明显发表偏倚，P>0.1。2rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答的关系有7篇符合分析条件的关于rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答关系的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：合并后的OR为1.57(95％CI：1.06-2.33，P=0.024)但各研究间存在异质性(I2=61.6%，P=0.016)。根据异质性检验结果对数据进行分层分析，按照乙型肝炎病人诊断类别分HBeAg阳性组和HBeAg阴性组进行分析。HBeAg阳性组的4篇文献仍然存在异质性(I2=77.7%，P=0.004)，采用随机效应模型分析结果如下：rs12979860位点显性模型（TC+TT vs CC）合并后的OR为0.717(95％CI：0.190-2.701，P=0.623)，证明rs12979860位点与HBeAg阳性慢性乙型肝炎病毒感染后干扰素治疗应答没有关联。HBeAg阴性组3篇文献采用固定效应模型分析结果如下：各研究间不存在异质性(I2=0.0%，P=0.710)。根据异质性检验结果对rs12979860位点显性模型（TC+TT vs CC）选择M-H固定效应模型进行数据合并，结果显示，合并后的OR为2.132(95％CI：1.15-3.95，P=0.016)，rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈正相关，突变基因型TC+TT显著提高HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。无发表偏倚。3rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除的关系共有3篇符合分析条件的关于rs8099917位点与HBV感染后自发清除的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：各研究间不存在异质性(I2=0.0%，P=0.705)。根据异质性检验结果对rs8099917位点显性模型(GG+GTvs TT)选择M-H固定效应模型进行数据合并，结果显示，合并后的OR为1.084(95％CI：0.72-1.623，P=0.696)，证明rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除没有关联。无发表偏倚。4rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答的关系有3篇符合分析条件的关于rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答关系的相关文献。对rs8099917位点显性模型(GG+GT vs TT) Meta分析的异质性检验显示：合并后的OR为0.400(95％CI：0.24-0.66，P=0.000)，证明rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈负相关，突变基因型GG+GT显著降低慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。各研究间不存在异质性(I2=36.8%，P=0.206)，无发表偏倚。结论：1通过Meta分析证实，IL28B rs12979860位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除以及HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答无关，与HBeAg阴性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答存在一定的相关性。IL28B rs12979860位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除以及HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答无关，与HBeAg阴性慢乙肝病人干扰素治疗应答呈正相关，以野生型等位基因C为参照，突变基因型TC+TT显著提高HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。2通过Meta分析证实，IL28B rs8099917位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除无关，与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈负相关，突变基因型GG+GT显著降低慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。