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大量研究表明壳寡糖具有抑菌、降血糖、抗氧化等多种生物活性,所以生产壳寡糖十分有意义,尤其以壳聚糖酶降解壳聚糖制备壳寡糖的方法较优。但是目前很少见到浓度超过6%的壳聚糖降解的相关报道,壳寡糖的生产效率较低。为了提高酶解过程中壳聚糖溶液浓度,提高工厂生产效率,改进壳聚糖酶解技术条件及过程,实现高浓度壳聚糖溶液高效酶解,本文主要探索了壳聚糖的溶解规律及溶液特性;探讨了壳聚糖酶的温度及pH稳定性,分析其酶解产物—壳寡糖的组成,为改进酶解条件奠定基础;应用壳聚糖溶液的溶解规律,提高底物反应浓度到10%～12%,分析在溶解过程中加酶的可行性,并比较在溶解过程中不同加酶方式对溶液粘度及酶解液中还原糖浓度的影响。研究结果如下:1.在溶解过程中,随着加酸至盐酸浓度达到0.44 mol/L,不同浓度壳聚糖溶液的透光率均是起初较低,待盐酸达到一定浓度后急剧上升,直至上升趋于平缓。壳聚糖浓度越高,脱乙酰度越高,导致透光率急剧上升的起始盐酸浓度越高;当壳聚糖浓度为8%时,1#和2#样品溶液的透光率在加酸浓度为0.23～0.34mol/L时显著升高(p<0.05),3#和4#样品溶液的透光率在盐酸浓度大于0.29 mol/L时才开始持续显著上升(p<0.05);4#分子量较小,加酸后,溶液最终透光率较高。2.盐酸浓度每增加约0.06 mol/L,浓度为8%的壳聚糖溶液电导率都是先均匀依次小幅增加,待盐酸达到一定浓度后增幅开始变大。1#和2#样品溶液电导率增幅变大分别始于盐酸浓度范围0.29～0.34、0.34～0.39 mol/L,而3#和4#样品溶液电导率增幅变大始于盐酸浓度范围为0.39～0.44 mol/L,推测此盐酸浓度范围内,壳聚糖分子近乎完全质子化,充分溶解,溶液透光率相应较高。壳聚糖脱乙酰度越高,溶液电导率开始大幅增加对应的盐酸浓度也越高,与溶液透光率变化结果相对应。3.1#～4#壳聚糖溶液浓度为8%时,分别在盐酸浓度为0.29、0.29、0.34、0.34 mol/L时粘度最大,分子伸展,之后随加酸进行壳聚糖分子成团,致使溶液粘度骤降;温度升高溶液粘度降低,但溶液粘度随盐酸浓度变化的规律不变;4.显微观察发现,随着加酸溶液中壳聚糖颗粒数显著减少,壳聚糖脱乙酰度越高,使颗粒全部崩解所需要的盐酸浓度越高,在颗粒全部崩解阶段溶液透光率、电导率剧烈变化,均显著升高。5.壳聚糖酶在pH4.5～5.5、低于55℃的范围内比较稳定,根据其pH稳定性范围,可为后续在不断加酸溶解过程中加酶降粘奠定基础,参照其温度稳定性范围,可适当提高溶解温度至55℃,再继续提高温度至60℃,则酶活损失严重。6.在55℃,pH5.5,5U/g壳聚糖条件下降解浓度为8%的4#壳聚糖,反应12h,产生的还原糖浓度约18 mg/mL,经TLC和HPLC对产物组成进行分析知酶解过程中不产生单糖,壳聚糖酶属内切酶,DP2～6的壳寡糖浓度不断增加至14.77 mg/mL,且其组成不断改变,以低聚合度壳寡糖为主。7.根据壳聚糖溶解行为的研究结果,可知盐酸在壳聚糖分子的溶解中发挥了关键作用。要提高溶液中壳聚糖的浓度,盐酸的加入量也需要相应提高,以保证充分溶解。另外,壳聚糖分子比较舒展时,会暴露更多糖苷键位点,此时加一定量的酶,利于发生降解反应,从而抑制高浓度壳聚糖溶液粘度大幅度上升的趋势,将溶解与酶解过程结合起来。再根据酶的pH稳定性研究结果知,需控制好加酸量,防止超出酶作用的较适pH值范围。综合上述研究结果,按每克4#壳聚糖加3/4 mL 6mol/L盐酸可以使壳聚糖分子具有较高的质子化程度,得到充分溶解,且在此加酸过程中壳聚糖分子链由于静电相互排斥作用而越来越舒展,溶液的pH最终在5.00左右,此pH对酶解反应没有显著影响。8.浓度为10%的4#壳聚糖的溶解和酶解过程改进研究的结果如下:浓度为10%的壳聚糖溶液在加酸浓度达到0.32 mol/L时,其粘度值非常大,因而需在加酸浓度小于0.32 mol/L时,加酶降粘。由于加酸过程中,溶液pH不断变化,且会造成溶液局部过酸,影响酶活。所以有必要选择不同加酶时机来试验,且按5 U/g壳聚糖加酶,在溶解过程中只加一部分酶为宜,溶解完成后,再补加剩余的酶。实验结果显示,在55℃下,盐酸浓度0.17 mol/L时,按1.7 U/g壳聚糖加酶,溶液粘度可降低约53.7%。之后补加酶活3.3 U/g壳聚糖,反应720 min后产生的还原糖浓度约30 mg/mL;若在酶解反应240 min时,再补加酶活2.5 U/g壳聚糖,反应到720 min后产生的还原糖浓度提高至约43 mg/mL,经TLC和HPLC对酶解产物组成分析知,DP 2～6壳寡糖的总含量约25.43 mg/mL。9.浓度为12%的4#壳聚糖溶液的溶解和酶解过程改进研究的结果如下:55℃下,在加酸浓度0.21 mol/L、0.41 mol/L时,分别按7.5 U/g、2.5 U/g壳聚糖加酶,溶液粘度降低超过70%。再按照5 U/g壳聚糖加酶进行酶解,酶解240 min时,又补加酶活1.7 U/g壳聚糖,可使溶液最终粘度降至400 cp左右,可实现浓度为12%的壳聚糖溶液体系的降解。