萘啶霉素是从链霉菌(Streptomyces lusitanus NRRL8034)中分离到的具有良好抗肿瘤活性的四氢异喹啉类生物碱,其结构类似物Ecteinascidin743已经作为抗肿瘤药物应用于临床。在彭超博士获得萘啶霉素基因簇并对其中部分基因功能进行了初步研究的基础上,我们对其二碳单元来源等生物合成中的核心问题进行了更为深入的研究。　　 通过构建orf(-1),orf(-4),orf(-5)等上游基因置换突变株,确定了萘啶霉素基因簇上游边界。通过构建甲基转移酶napV,napS的基因置换突变株,确定了NapV对萘啶霉素的氮甲基化为后修饰步骤,而NapS的碳甲基化更可能是前体修饰。通过在S.coelicolerCH999中异源表达napI,napQ,napS,napT等酪氨酸前体修饰基因,证实其负责为萘啶霉素合成过程中提供完整修饰的酪氨酸衍生物单元,对NapI的蛋白体外测活实验也验证了其对酪氨酸衍生物的氧化作用,与异源表达结果相符。通过对NapC,NapX进行蛋白体外表达和酶学机制研究,确定NapX为萘啶霉素基因簇中特异活化其酰基载体蛋白NapC的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。通过构建napF基因置换突变株并对其发酵检测,结果表明napF缺失后萘啶霉素及其类似物完全不产生,但其具体功能仍然未知。　　 通过对S.lusitanus NRRL8034发酵条件进行优化,显著提高了萘啶霉素的发酵产量,并分离到了氰化萘啶霉素标准品,为后续的工作提供了标准品参照以及酶反应所需的底物前体。　　 通过对萘啶霉素基因簇中二碳单元相关蛋白NapD序列信息进一步分析,发现其与基础代谢中的转酮酶有较高同源性,由此推测萘啶霉素中未知来源的二碳单元来自酮糖。这一推测通过2-13C-葡萄糖、1-13C-果糖等化合物的标记喂养实验得到证实,这一结果也解答了四氢异喹啉家族三十年以来一直悬而未决的问题。　　 通过对napD基因置换突变株及我们构建的napB基因置换突变株进行同源互补及奎诺卡星同源蛋白编码基因qncL及qncN的异源互补实验,证实NapB,NapD与QncN,QncL功能完全一致,并且与萘啶霉素骨架合成相关,这一结果为随后的奎诺卡星二碳单元蛋白QncN,QncL体外活性研究奠定了基础。　　 通过构建napG回补突变株以及napG基因置换突变株进行发酵检测,确定了基因置换突变株中萘啶霉素产量大量下降的变化是来自于NapG功能的缺失。这一结果说明肽酶NapG对萘啶霉素的生物合成非常重要。结合SFM-A的研究进展,我们推测NapG很可能负责水解萘啶霉素前体中的酰基肽链,而对NapN及NapO的蛋白序列分析表明其可能参与了这一酰基肽链前体的合成。　　 进一步对NapO中A结构域核心基序的分析,我们认为NapO负责产生一个聚三丙氨酸作为酰基肽链中多肽结构。通过对NapN的蛋白序列分析以及蛋白表达及酶学活性测试,表明NapN识别和活化的底物可能为十四酸。由此推断,萘啶霉素生物合成前体中的酰基肽链结构应为十四酸聚三丙氨酸。这为我们深入研究NapG的肽酶作用机制提供了重要的底物结构信息。　　 通过对构域分别进行蛋白表达,我们获得了NapO中三个A结构域的Nus融和蛋白;NapN中ACP结构域两种长度划分的蛋白;NapG中肽酶核心功能域的Nus融合蛋白;为进一步研究NapN、NapO以及NapG的酶学功能研究提供了条件。　　 总之,本文在深入分析萘啶霉素基因簇信息的基础上,通过对部分关键基因进行体内敲除、互补、蛋白表达测活等实验,结合优化的发酵条件,通过前体标记喂养实验,共同阐明了萘啶霉素生物合成中的二碳单元的形成,并对萘啶霉素中隐性的前体酰基肽链形成及解离展开了研究。这些结果不仅为我们更深入的认识四氢异喹啉家族类化合物的生物合成机制提供了帮助,也为代谢工程改造、组合生物合成ET-743或与其结构更为类似的中间体提供了线索。