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本实验室前期的研究已经证实,日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原26-28kDa(SIEA26-28kDa)和成虫31-32kDa蛋白(Sj31-32kDa)天然分子均可诱导宿主产生较好的抗雌虫、抗卵胚免疫效果。但是由于天然分子抗原疫苗的分离及批量制备相对困难,束缚了其在现场防治中的应用。近几年来,本课题组一直致力于筛选、鉴定天然分子疫苗的编码基因,随后构建了几种天然分子疫苗相关的核酸疫苗,包括SIEA26-28kDa相关的pcDNA3.0/SjHGPRT、pcDNA3.0/SjSDISP、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjRPL7,Sj31/32kDa相关的pcDNA3.0/SjCB等,并证实几种疫苗均能产生一定程度的免疫保护力,但单一的核酸疫苗的免疫保护效果尚有待进一步提高。因此,本研究内容之一是将SjRPS4、SjCB两种编码天然分子疫苗的目的基因构建成双价疫苗,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫攻击感染的保护效果;研究之二是通过采用“初免-加强”的免疫策略,将pcDNA3.0/SjSDISP核酸疫苗、Sj31-32天然分子疫苗联合起来进行免疫,观察是否可以在减少天然分子疫苗的用量的同时,达到同样理想的免疫保护效果。研究目的1、针对抗日本血吸虫病天然分子靶基因,构建双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB并获得良好的表达;2、观察pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB双价疫苗及pcDNA3.0/SjSDISP、Sj31-32疫苗联合免疫诱导宿主产生免疫保护的效果。研究方法1、双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pET-32a/SjRPS4·CB的构建分别以pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB为模板,设计引物扩增SjRPS4、SjCB,重叠PCR法将SjRPS4、SjCB拼接并扩增,鉴定后与真核质粒载体pVAX1、pcDNA3.0、原核质粒载体pET-32a连接,转化至DH5α或BL21(DE3)细胞。对阳性克隆鉴定并测序证实之。2、SjRPS4·CB的表达及pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB的免疫保护性观察提取pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB,100μg/只经左腿股四头肌注射昆明小鼠,14d后取肌肉组织切片进行间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色,同时设pVAX1、pcDNA3.0空载体、PBS阴性对照组和pVAX1/SjRPS4阳性对照组,观察其表达。大量提取pVAX1/SjRPS4·CB、空pVAX1质粒,pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB及空pcDNA3.0质粒,每只小鼠100μg或等量PBS经左腿股四头肌注射进行免疫。4周后以20±1条尾蚴贴腹感染,感染6周后检测减虫率、减卵率。3、pcDNA3.0/SjSDISP核酸疫苗初免、Sj31-32蛋白疫苗加强的联合免疫收集日本血吸虫尾蚴感染45天后的成虫,制备成虫可溶性抗原,SDS-PAGE分离纯化Sj31-32,测定蛋白浓度备用。质粒pcDNA3.0/SjSDISP经测序鉴定后进行大量提取,测定浓度备用。联合免疫组以pcDNA3.0/SjSDISP 100μg/次~*2次肌肉注射初免,Sj31-32 50μg~*1次皮下注射加强;其他组注射相应等量单种疫苗/空载体/生理盐水。每次免疫间隔2周,共3次。末次免疫后2周以20±1条尾蚴贴腹感染,45d后检测减虫率、减卵率。研究结果1、PCR、EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切及测序均显示重组质粒的插入序列与目的基因SjRPS4·CB ORF完全一致,说明双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pET-32a/SjRPS4·CB构建成功。2、昆明鼠肌肉组织间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色显示免疫组小鼠肌细胞中呈现较强的绿色荧光或棕黄色颗粒,而阴性对照组肌细胞呈阴性。证实pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB在小鼠肌肉细胞内能够成功表达。3、与PBS组相比,pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB免疫小鼠分别获得了31.3%、27.6%、25.2%、26.4%的减虫率、29.7%、31.5%、24.1%、26.2%的每雌子宫减卵率和58.8%、56.2%、44.9%、46.0%的每克肝减卵率,与PBS组比较各组均有显著性差异(P＜0.05);各免疫组与相应的空质粒组相比各指标均具有显著性差异(P＜0.05);两种不同载体构建的双价疫苗之间相比,各指标无显著性差异(P＞0.05);双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB与单价疫苗pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB相比,减虫率、每雌子宫减卵率无显著性差异(P＞0.05),但肝减卵率有显著性差异(P＜0.05)。提示:不同载体构建的双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB免疫小鼠可以产生相似的抗日本血吸虫攻击感染的保护力;双价疫苗与单价疫苗相比肝减卵率具有显著性差异。4、与生理盐水组相比,Sj31-32天然分子组、pcDNA3.0/SjSDISP真核重组质粒与Sj31-32天然分子联合组分别获得29.7%、40.6%的减虫率,30.1%、40.7%的每雌子宫减卵率,66.9%、69.8%的粪减卵率,41.9%、55.4%的每克肝减卵率及50.2%、49.2%的每克肠减卵率,与生理盐水组比较均具有显著性差异(P＜0.01),而两组间比较差异不显著(P＞0.05)。与生理盐水组相比,pcDNA3.0/SjSDISP真核重组质粒免疫小鼠获得22.5%的减虫率,16.6%的每雌子宫减卵率,56.4%的粪减卵率,42.2%的每克肝减卵率,47.8%的每克肠减卵率,具有显著性差异(P＜0.01)。空pcDNA3.0组与生理盐水组相比,各指标亦具有显著性差异(P＜0.01);而pcDNA3.0/SjSDISP真核重组质粒与空pcDNA3.0组相比差异不显著(P＞0.05)。提示:pcDNA3.0/SjSDISP真核重组质粒初免-Sj31-32天然分子加强的免疫方案可以产生与Sj31-32天然分子单独免疫相似的免疫保护效果;空pcDNA3.0质粒可以产生一定的免疫效应。结论1、真核重组质粒pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB与原核重组质粒pET-32a/SjRPS4·CB构建成功。2、真核重组质粒pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB在昆明鼠肌肉细胞内获得良好表达。3、pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB双价疫苗免疫昆明小鼠均可以产生比单价疫苗更优的免疫保护效果。其中前者是基于pVAX1人用载体构建的,为下一步的应用打下了基础。4、pcDNA3.0/SjSDISP、Sj31-32联合免疫在减少天然分子用量的同时,可以获得与Sj31-32单独免疫相似的保护效果。