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疫苗行业的快速发展为人类预防疾病提供了有力的保障。目前常用的疫苗包括病毒性疫苗和细菌性疫苗两类,其中,病毒性疫苗是应用最早、最广泛并且种类最多的一种。传统病毒性疫苗的生产工艺采用原代细胞和滚瓶的生产方法,具有劳动强度大,批次差异大,病毒滴度低等缺点。1967以来,微载体培养技术的出现使大规模自动化培养贴壁动物细胞生产生物制品成为可能,并已经成为未来贴壁哺乳动物细胞大规模培养发展的趋势。Vero细胞是非洲绿猴肾的传代细胞,易于大规模培养,胞核学稳定,无外源因子污染,无致瘤性,是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质,被广泛应用于病毒性疫苗的生产。Cytodex系列微载体是由葡聚糖表面接枝DEAE或者变性胶原制作成的微球,目前已经成为应用最广泛的细胞培养微载体。Vero细胞微载体培养工艺的开发涉及很多关键技术,其中培养模式的选择和培养规模的逐级放大一直是生产中的难点。本文首先研究了Vero细胞二维和三维微载体培养的生长情况,然后通过转瓶手动模拟再循环培养方式,研究了Vero细胞再循环培养工艺的可行性。接下来从Vero细胞微载体放大培养工艺开发过程中的关键问题入手,提出一种全新的微载体“球转球”放大思路,即通过对长满Vero细胞的Cytodex 3微载体进行一定程度胰酶的消化处理(定义为“半消化状态”),按照新老载体2:1比例添加新球,两阶段间歇搅拌接种进行“球转球”放大培养,并与另外两种放大培养方法进行比较分析。首先通过Vero细胞Cytodex 3批培养,分析了Vero细胞微载体培养的要点;然后通过手动模拟再循环模式培养Vero细胞,循环体积从2VVD到3VVD,经过7天培养,获得了2.2×107 /mL的最高密度;然后通过在12孔板以及平皿中使用胰酶作用不同时间处理载体上细胞进行条件摸索,定义胰酶消化处理5min为Cytodex 3微载体上Vero细胞部分缩圆的“半消化”状态,之后对微载体上Vero细胞进行完全消化、半消化、无消化(直接球转球)三种方式处理。经过8天培养,结果显示,对Cytodex3上Vero细胞进行“半消化处理”比其他两种方法(在位全消化,直接球转球)能更有效的提高细胞密度和细胞形态,得到了最高细胞密度7.9×105/mL,Vero细胞在微载体上分布更加均匀,空载率最低为15%,细胞生理状态更加一致,更有利于病毒接种和疫苗生产。本文结果表明Vero细胞胰酶半消化处理能有效地提高Vero细胞球转球放大效率,最终细胞密度更高,细胞在新老载体分布更均匀,空载率更低。本研究为Vero细胞生物反应器微载体培养工艺的开发与球转球放大培养提供了一种新的思路,同时为开发连续在位Vero细胞放大生物反应器提供了参考。