骨髓间充质干细胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)具自我复制及多向分化潜能，能分化为骨、软骨、脂肪、肌细胞和各种血细胞等。同时，MSCs取材方便，在体外易于分离，培养和扩增，因此得到了很多学者的关注。进一步研究表明<[3]>，在不同的微环境下MSCs还可向某些附属器官分化，如脂肪细胞、格根包尔式细胞、血管内皮细胞和汗腺细胞等。在体外条件下还有人将成纤维细胞培养的上清液和EGF等加入到培养体系中，MSCs出现了表皮细胞表型角蛋白的表达。这些研究都表明，MSCs在创伤修复尤其是皮肤损伤修复方面具有广阔的前景和越来越重要的意义。 MSCs的分化要经过一系列复杂的信号调控并与靶器官相互作用，信号平衡的改变可能导致分化结果的迥然不同，但其具体机制尚不清楚。小分子GTP酶Rho家族(RhoGTPases)是调节细胞功能的一类重要蛋白分子，参与弹性纤维形成、细胞凋亡及多条信号通路的调节；Rho/ROCK(RHO-dependent protein kinase)信号途径是诸多调控细胞增殖的酪氨酸激酶受体信号通路的枢纽，与细胞骨架构成、极性生长和细胞周期进程关系密切。现有证据表明，调控ROCK活性对于神经元细胞、T淋巴细胞以及角质细胞的分化相当重要，ROCK的抑制剂还能够加速MSCs向神经元样细胞的分化。2003年Raffaella等<[4]>研究发现，Rho/ROCK信号途径是决定向脂肪和肌形成过程中的关键分子开关，并认为对于MSCs的分化可能同样具有意义。在诱导MSCs向表皮细胞分化过程中，本实验选择Rho/ROCK信号转导通路抑制剂HA-1077(fasudil，法舒地尔)，通过对Rho/ROCK信号途径的干预，利用体外细胞培养、免疫细胞化学、流式细胞仪等技术，从细胞生物学、细胞表型表达等方面来观测其对人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymal stem cells，hMSCs)向表皮细胞分化的影响。 目的 探讨在特定条件下法舒地尔(HA-1077)对hMSCs向表皮细胞表型分化的影响。 方法 1、取胎儿股骨骨髓腔抽洗液，Ficoll-Paque密度梯度离心法提取、培养并扩增hMSCs，流式细胞仪测定细胞表面CD34、CD44表达。 2、采用儿童新鲜包皮组织帖壁培养纤维细胞并收集上清液。 3、体外诱导MSCs向表皮细胞表型分化的实验分为4组：①对照组(培养基采用10％FBS/DMEM)；②诱导组(培养基，采用10％FBS/DMEM+30％人成纤维细胞上清液+10ng/mlEGF)；③HA-1077诱导组1(培养基采用10％FBS/DMEM+30％人成纤维细胞上清液+10ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)；④HA-1077诱导组2(培养基采用10％FBS/DMEM+30％人成纤维细胞上清液+10ng/mlEGF+30μmol/L HA-1077)。 4、流式细胞仪检测鉴定分组诱导2天后hMSCs CK5/8表达。 5、免疫细胞化学染色鉴定各组hMSCs诱导4天后CK5/8的表达并观察细胞形态变化，具体操作按试剂盒说明书进行。 6、在诱导7天后测定各组细胞CK5/8、CK10/13、CK19表达和PCNA、P．ERK的阳性率及细胞周期变化。 7、采用SPSS13.0软件对数据进行统计学处理，多个样本均数比较选用单因素方差分析、两两比较选用最小显著差法。p<0.05被认为有统计学意义。 结果 1、采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取、培养并扩增人胚胎股骨MSCs均一性良好，流式细胞仪检测结果显示CD34阳性率约为0.12％，CD44阳性率约为91.53％。 2、分组培养48h后各组细胞形态无明显变化，流式细胞仪鉴定显示①对照组、②诱导组、③HA-1077诱导组、④HA-1077诱导组<,2>CK5/8阳性表达率分别为0.23±0.05％、0.95±0.09％、1.14±0.11％、2.46±0.49％，呈上升趋势。诱导前后即MSCs①和②③④组差异均有统计学意义(p<0.05，p<0.01，p<0.01)。随着时间延长，MSCs②③④中角蛋白阳性表达逐渐提高。 3、诱导后4天免疫细胞化学显示：各诱导组细胞形态仍无明显变化，免疫细胞化学染色可见MSCs①无CK5/8的表达，余各组均呈现不同程度的CK5/8的表达，以MSCs③④培养基诱导的表达最多。和第2天流式细胞仪测定结果一致。 4、诱导7天后流式细胞仪测定表明，MSCs①②③④四组中CK5/8、CK10/13、CK19的阳性表达率(见表1)均明显呈上升趋势，在三种角蛋白的比较中：HA-1077作用前、后即MSCs②组与③或④组比较差异均显著(p<0.01，p<0/01)，单纯诱导前、后即MSCs①与②组比较均有统计学意义(p<0.05)。 5、流式细胞仪显示诱导7天后单纯诱导组即MSCs②组与HA-1077作用组即MSCs③中PCNA的阳性表达率均高于(9.78±3.33％，10.72±1.05％；p<0.01，p<0.01)对照组MSCs①(3.31±0.76％)。同时，细胞周期表明在MSCs①②③组中处于G0/G1期的细胞逐渐减少，处于S期的比例上升；其中单纯诱导前、后即MSCs①与②组比较(p<0.05)，HA-1077作用前、后即MSCs②组与③组比较(p<0.01)差异显著。 6、诱导7天后流式细胞术结果显示HA-1077作用前、后即MSCs②组与③组之间的P-ERK阳性表达率比较差异显著(p<0.01)。 结论 1、采用密度梯度离心法可得到成份均一、纯度高的hMSCs，经流式细胞仪鉴定具有MSCs的表面标志。 2、证实MSCs在体外特定条件下诱导可发生向表皮细胞的转分化；HA-1077可显著提高hMSCs在条件诱导下CK5/8、CK10/13、CK19的阳性表达率。 3、HA-1077在体外条件诱导下能使hMSCs增殖能力提高，分化能力增强，大部分由G1期转变为S期，促进hMSCs向表皮细胞表型的分化。Rho/ROCK信号途径可能在MSCs向表皮细胞分化中扮演重要角色。