长牡蛎(Crassostrea gigas),又称太平洋牡蛎,分类学隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lanellibranchia)、珍珠目(Pterioida)、牡蛎科(Ostreidae)、巨蛎属(Crassostrea),是一种广温、广盐的重要海水经济双壳贝类,其作为潮间带这一特殊环境的典型物种,被当做海洋生物对潮间带环境适应性研究的模式生物。由于其独特的生态价值和经济价值被广泛养殖,是世界上最重要的海水养殖物种。我国山东省是长牡蛎的主养区之一,但是在最近几年,经常有报道长牡蛎存在大规模死亡的现象,尤其在夏季海水温度升高时死亡率达到最高,这在一定程度上困扰着长牡蛎产业的发展。有初步研究表明,导致大规模死亡这一现象发生可能主要是由于高温胁迫、个体生理状态以及病原微生物所导致,但是并没有整体系统的研究。针对这一问题,本研究对长牡蛎的夏季大规模死亡展开了系统的环境及生物学调查,并且通过转录组获取胁迫响应的基因集,对其分子机制进行初步研究,结果如下:1.本研究对乳山长牡蛎养殖区高温季节水文条件(温度、溶解氧、p H值、盐度)指标进行了较为详细的检测,统计了对应各时间点养殖水体里的浮游植物数量,计算了各采样时间点长牡蛎的条件指数变化情况,并且筛选部分抗性基因对不同季节的长牡蛎鳃组织进行定量表达。结果表明,HSP70基因在7月份显示出高表达,PFK、My D88、MPI2、Lys和IL-17等免疫基因均在8月份出现了表达峰值,在其余各月份表达量较低。对水文数据进行检测的6-9月中,发现海水最高温出现在8月,这一结果和我们得到的高表达月份相吻合。分析长牡蛎条件指数的差异表明,这一指标与环境的变化密切相关。对西黄岛远岸海区藻类的统计结果表明,近岸的藻类丰度更大。这些结果初步揭示了长牡蛎度夏的养殖环境,并且认为温度是引起长牡蛎死亡的主要因素。2.产卵作为机体的内部影响因素在长牡蛎度夏死亡期间起着一定的作用,我们通过人工促熟的方法在同一时期获取了两种不同繁殖状态的群体(未促熟和产卵后),目的是了解产卵对长牡蛎的生理状况产生的影响,主要比较了两种群体的糖原含量、条件指数以及呼吸率等生理指标。结果表明,产卵导致长牡蛎的糖原含量显著下降,同样条件指数也伴随着产卵显著降低,糖原作为机体能量的重要储能物质,与个体的抵抗力有着密切的关联。分析呼吸率的计算结果,在同一温度下,长牡蛎产卵后的呼吸率明显高于未促熟的个体,这可能是一种呼吸代偿机制。3.长牡蛎的繁殖活动影响了机体抵抗外界胁迫的能力,在各种环境及生物因素中,温度和病原体的感染被认为是影响长牡蛎存活情况的重要因子。我们分别对产卵前后的长牡蛎个体进行了35℃的热应激处理和溶藻弧菌的注射处理,在应激后选择一定的时间点剪取个体的鳃组织进行转录组测序,通过计算获得不同繁殖状态下的群体受到胁迫后的差异基因集,并且对未促熟和产卵后的群体分别特有的显著差异基因进行富集分析,比较系统地研究长牡蛎群体响应胁迫的分子机制。结果表明,通过对差异基因数量的统计发现不同繁殖状态的长牡蛎在受到热激后的响应程度差异较大,产卵后的群体明显更易受到热激的影响;而受到弧菌感染后两个群体的响应程度都比较大。富集分析发现,未促熟的群体在热激后没有富集到有生物学功能上的差异,而产卵后群体的代谢过程加快,细胞凋亡相关基因上调,该群体的免疫能力下调。与热激组相比,注射溶藻弧菌后对产卵前后的群体都有比较大的影响,其中未促熟群体代谢过程上调,而免疫功能受到了抑制;产卵后群体对胁迫的响应能力被削弱并且自我修复过程受到一定的影响。综上所述,长牡蛎的度夏死亡问题由多种因素之间相互作用所引起。本研究结果表明,产卵导致长牡蛎的生理状态不佳,很大程度上削减了机体对高温及病原体胁迫的抵抗能力,导致长牡蛎大规模死亡的发生。