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目的:c-Maf在50%以上的多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞中高表达,通过其下游靶基因及与其他信号因子的相互作用促进MM的发生和恶性进展,与MM的化学耐药、临床恶变和不良预后密切关联。我们前期研究表明,去泛素化酶USP5通过稳定c-Maf蛋白从而促进MM细胞增殖和存活,表明USP5/c-Maf轴可能成为多发性骨髓瘤治疗的潜在靶点。本文建立了一个基于USP5/c-Maf的荧光素酶报告基因系统,用于筛选新型的抗多发性骨髓瘤药物,并阐明其抗MM的作用机制。方法:(1)构建USP5/c-Maf/MARE荧光素酶报告基因系统,从FDA批准的药物库中筛选USP5/c-Maf抑制剂。(2)通过免疫印迹技术,检测候选化合物对多发性骨髓瘤细胞株LP1细胞凋亡相关蛋白及c-Maf的蛋白表达情况。(3)使用RT-PCR技术分析MBZ对c-Maf及USP5的mRNA表达水平的影响。(4)用MBZ处理LP1和RPMI-8226细胞24小时,使用免疫共沉淀技术和WB技术,分析MBZ对c-Maf与USP5结合作用的影响。(5)使用免疫沉淀技术和WB技术分析MBZ对c-Maf泛素化水平的影响。(6)利用荧光素酶报告基因技术和RT-PCR技术,分析MBZ对c-Maf转录活性的影响。(7)利用WB技术和流式细胞术分析MBZ对多发性骨髓瘤细胞株凋亡的影响。(8)利用免疫印迹技术分析MBZ与WP1130或柔红霉素(DNR)联合用药对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响。(9)通过构建裸鼠异体移植模型,分析MBZ对体内多发性骨髓瘤肿瘤生长的影响。通过测定裸鼠体重及血液样本分析来评估MBZ的毒性大小。结果:(1)通过荧光素酶报告基因系统筛选,发现30种化合物可显著降低荧光素酶活性,为潜在的USP5/c-Maf抑制剂。(2)WB及RT-PCR分析发现,MBZ能显著诱导凋亡相关蛋白PARP发生剪切并降低c-Maf的蛋白水平且不影响其mRNA水平。(3)MBZ可显著降低USP5和c-Maf蛋白水平,并且从mRNA水平抑制USP5表达,但对c-Maf的mRNA无影响。(4)HEK293T 细胞及 MM 细胞(LP1 和 RPMI-8226)的 Co-IP 结果显示 MBZ可显著抑制USP5与c-Maf的相互结合。(5)MBZ诱导的c-Maf蛋白降解可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转,MBZ可显著增强c-Maf的多聚泛素化水平,表明MBZ诱导的c-Maf降解是通过泛素蛋白酶体途径的。(6)MBZ能有效抑制MARE驱动的荧光素酶报告基因活性,同时RT-PCR结果显示MBZ可显著抑制c-Maf下游靶基因CCND2、ITGB7和ARK5的mRNA水平。(7)免疫印迹分析发现MBZ能够显著促进c-Maf高表达的MM细胞株(LP1、RPMI-8226)中凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3的剪切,而c-Maf不表达细胞株U266中仅有少量PARP发生剪切,且无Caspase-3剪切发生。进一步通过流式细胞术分析发现,MBZ能诱导LP1和RPMI-8226细胞凋亡(凋亡率分别为19.4%和18.12%),但对不表达c-Maf的MM细胞株U266效果较弱(凋亡率为10.09%)。(8)联合用药实验发现,与单独用药组相比,MBZ与WP1130或DNR联合使用时均能显著增加PARP剪切,并更多地促进c-Maf蛋白降解。(9)MBZ能够抑制肿瘤异体移植模型中骨髓瘤的生长。同时,通过测定裸鼠体重及血清生化指标发现,给药组与对照组体重及血清生化指标无统计学差异,这些结果显示MBZ在体内的毒性较小。进一步提取肿瘤组织蛋白,通过免疫印迹分析发现MBZ也可显著降低肿瘤组织中USP5和c-Maf的蛋白水平,并显著诱导凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3发生剪切。结论:在体内体外实验中,MBZ都表现出较强的抗MM活性,且其体内毒性较低。同时,MBZ通过USP5/c-Maf轴来诱导c-Maf发生泛素化降解,诱导MM细胞凋亡,从而发挥抗MM活性。综上所述,本文发现了一种新型的抗多发性骨髓瘤药物甲苯咪唑,它可通过USP5/c-Maf轴诱导骨髓瘤细胞凋亡,在多发性骨髓瘤治疗中具有潜在的应用前景。