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Pif1解旋酶是一类依靠ATP提供能量,沿着DNA链从5’-3’方向移动打开DNA螺旋的核酸解旋酶。Pif1广泛存在于生物体内,研究较多的物种有:酿酒酵母、裂殖酵母、人类和小鼠。体内活性研究表明,Pif1解旋酶在维持染色体DNA、线粒体DNA和核糖体DNA稳定性方面具有重要作用:Pif1基因的突变导致DNA重组异常,影响细胞正常生理活动;在重组修复方面Pif1解旋酶可以帮助细胞识别双链断裂区(DSB),修复断裂的双链DNA;同时,Pif1解旋酶还作用于染色体末端,抑制端粒酶的活性,使细胞维持正常的生命周期。体外活性研究多是截短的Pif1解旋酶,主要包括截短的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae H.Pif1(ScPif1)和截短的人类Pif1(hPif1)。研究表明,Pif1解旋酶具有严格的5’-3’方向的解旋极性并且其结合和解旋G4 DNA底物的活性远高于其他解旋酶家族成员。尽管对Pif1解旋酶的研究取得了一些成果,但是Pif1解旋酶的解旋机理还不是很清楚。另外,由于真核生物Pif1解旋酶难以获得全长蛋白,因此对Pif1蛋白整体认识不足。本研究以一种热脱硫弧菌Thermodesulfovibrio yellowstonii H.Pif1(TyPif1)为材料,通过表达、纯化获得高纯的全长TyPif1蛋白,在体外条件下研究TyPif1的DNA结合和解旋活性以及热稳定性,为深入研究TyPif1解旋酶的解旋机理提供有益的帮助。本研究获得的成果如下:1.人工合成经过密码子优化的TyPif1基因,将该基因和SUMO促溶标签共同连入pET15b载体中,重组质粒pET15b-SUMO-TyPif1导入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。可溶性蛋白先经过Ni柱粗提,然后用SUMO蛋白酶切融合蛋白,再次过Ni柱除去SUMO标签,最后使用Heparin柱精细纯化。1 L菌液可以获得约10 mg纯度大于95%的全长热脱硫弧菌Pif1蛋白。2.通过TyPif1解旋酶结合不同长度的单链DNA活性的测定,得出其binding size为11.27 nt。通过TyPif1解旋酶结合单链DNA、双链DNA、G4 DNA的活性的比较,其结合单链DNA和G4 DNA的活性显著高于双链DNA。3.圆二色谱(CD)扫描不同温度下TyPif1解旋酶吸收谱带的变换,结果显示,TyPif1在温度为20-60℃时二级结构相对稳定,表明TyPif1在低于60℃时具有良好的热稳定性。解旋活性实验发现TyPif1解旋酶随着温度的升高解旋速率由0.09 s-1增加到0.23 s-1,这一结果与热脱硫弧菌T.yellowstonii在其生活环境中的生长和代谢相符合。4.通过热脱硫弧菌Pif1解旋酶解旋双链DNA和G4 DNA的比较,发现TyPif1解旋G4 DNA的速率高于双链DNA的速率,并且G4 DNA的存在激活了TyPif1解旋双链DNA的能力。本研究建立了TyPif1解旋酶表达、纯化体系,通过体外活性研究明确了其最适结合底物和最适解旋底物,本研究得出的结论可为后续深入研究TyPif1解旋酶解旋机理提供参考。