家兔无乳链球菌的分离鉴定及其感染的动态病理学与病原分布研究

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2011年7月四川绵阳某家兔养殖场爆发了以四肢麻痹、划游和呼吸障碍为特征的疾病,死亡率达42%;从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到一株链状革兰氏阳性球菌(P110323),以浓度为1×106CFU/mL的P110323菌株培养液灌胃感染健康家兔,家兔出现站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,并逐渐死亡;解剖可见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅。P110323在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落,在5%的脱纤维羊血平板上形成透明的p溶血环,V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇产酸为阴性。药物敏感性实验结果显示氨苄西林、庆大霉素、氟哌酸、奥复星、复达欣和氟苯尼考对P110323有效,四环素、强力霉素的抑制作用为中介;青霉素,链霉素,阿莫西林、丁胺卡娜及妥布霉素对其无效。16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇;gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S. agalactiae).结合细菌形态特点和生理生化特性,鉴定该P110323为无乳链球菌(S. agalactiae),多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为la型。采用灌胃接种的感染方式建立S. agalactiae人工感染家兔的病理模型,观察和记录家兔感染后的临床症状,并在接种后的0h,6h,12h,18h,24h,48h,72h,96h......10d时间点,随机抽取试验组和对照组家兔各2只,腹腔注射过量的戊巴比妥让其死亡,解剖后取脑、心、肝、脾、肾、肺等重要的组织器官进行组织病理学、超微病理学研究,同时建立基于无乳链球菌cfb基因的间接原位PCR检测方法研究无乳链球菌感染家兔后的侵染规律。结果表明S. agalactiae主要引起胃、肺、肝、脾、肾、小脑等组织的损伤,并导致家兔体内发生弥散性血管内凝血(Disseminated intravascular coagulation, DIC),引起死亡。接种6h后,在胃组织中检测出S. agalactiae,引起胃组织充血,黏膜上皮坏死、脱落;12h在脾和肺中检测到S. agalactiae,脾可见巨噬细胞增多和淋巴细胞减少,随着病情发展,脾出现弥漫性坏死,细胞结构模糊不清;肺在感染初期表现为充血、出血,大量巨噬细胞出现在肺泡腔内,后期在肺泡隔的小血管中形成微血栓;24h在肝和肾中出现阳性信号,S. agalactiae主要引起肝淤血、肝细胞颗粒变性及溶解坏死,并逐渐在门管区血管中形成血栓;肾主要表现为肾小管上皮细胞坏死脱落,肾小球毛细血管中形成透明血栓;2d后在心肌和小脑中检测到阳性信号,心肌肌纤维胞浆浓缩,逐步演变为肌纤维的断裂坏死;小脑中S. agalactiae主要集中在分子层,引起神经细胞的溶解坏死,神经元髓鞘结构增厚。
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