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镉作为环境中常见的重金属污染物,可引起多种器官和组织的损伤。近年来,随着镉生产、使用量的增加及工业污染加重,使得环境中镉含量快速上升,镉暴露造成的公众健康危害引起广泛关注。肾脏是镉毒性作用最主要靶器官之一,其中,肾小管是镉毒性损伤主要靶位点,机体长期接触镉将会造成肾脏不可逆损伤。葛根素是从植物野葛干燥根中提取的一种异黄酮类化合物,具有抗氧化、降血糖和改善微循环等药理活性,且毒性低、代谢快,安全可靠,在临床上被广泛用于治疗心血管疾病和糖尿病及并发症等。线粒体是细胞内重要的双层膜细胞器,除了为细胞正常生命活动提供必需能量外,还参与细胞分化、信号传递和细胞凋亡等过程。线粒体自噬被认为是线粒体质量和数量控制的主要途径。目前,葛根素与线粒体自噬在镉致肾脏毒性过程中的研究较少。本文以原代大鼠肾小管上皮细胞为模型,研究葛根素如何通过调控线粒体自噬在镉致细胞凋亡中发挥保护效应,为防止镉对肾脏的毒性作用提供新思路。1.镉对原代大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响采用机械碾磨结合胶原酶消化法获取原代大鼠肾小管上皮(rPT)细胞。在对数生长期,用不同浓度镉(0,1.25,2.5μM)处理rPT细胞12h,利用CCK-8法测定细胞活力;DAPI染色后利用激光共聚焦显微镜观察细胞核形态学变化、利用流式细胞术检测细胞凋亡率、利用免疫印迹法检测Cleaved caspase-3蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,染镉组细胞活力明显降低(P<0.05或P<0.01);部分细胞核皱缩、凹陷,细胞凋亡率显著升高(P<0.05或P<0.01),Cleaved caspase-3蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01)。以上结果说明,低浓度镉长期暴露能引起rPT细胞存活率降低,并导致细胞凋亡。2.镉对原代大鼠肾小管上皮细胞线粒体自噬的影响不同浓度镉(0,1.25,2.5 μM)处理rPT细胞12 h,利用萤火虫荧光素酶发光法检测ATP含量、DCFH-DA探针法检测ROS含量、JC-1探针法检测线粒体膜电位(MMP);利用透射电子显微镜观察线粒体超微结构及被包裹的线粒体数量、Mito-Tracker Red探针标记后利用激光共聚焦显微镜观察线粒体网状结构、Mito-Tracker Red和Lyso-Tracker Green探针共标记后利用激光共聚焦显微镜观察线粒体与溶酶体共定位水平;采用QRT-PCR法和蛋白免疫印迹法检测线粒体自噬相关基因和蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,染镉组ATP含量和MMP明显降低(P<0.05或P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.05或P<0.01);线粒体超微结构破坏,嵴断裂、膜破坏及基质模糊,线粒体网状结构断裂,被包裹线粒体数量增加,线粒体与溶酶体共定位水平增加;DRP1、PINKI、Parkin基因及蛋白表达量均显著增加(P<0.05或P<0.01)。以上结果说明,低浓度镉长期暴露能造成rPT细胞线粒体损伤,并导致线粒体自噬发生。3.镉致原代大鼠肾小管上皮细胞损伤中线粒体自噬对细胞凋亡的影响线粒体分裂抑制剂Mdivi或PINK1 siRNA与镉共处理rPT细胞12 h,利用免疫印迹法检测线粒体自噬相关蛋白和Cleaved caspase-3蛋白表达量、利用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,与单独染镉组相比,Mdivi或PINK1 siRNA与镉共处理组PINK1和Parkin表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01),Cleaved caspase-3蛋白表达量和细胞凋亡率显著下降(P<0.05或P<0.01)。以上结果说明,抑制线粒体自噬可阻断镉导致的rPT细胞凋亡。4.葛根素对镉致原代大鼠肾小管上皮细胞线粒体自噬和凋亡的影响葛根素与镉共处理rPT细胞12 h,采用CCK-8法测定细胞活力、JC-1探针法检测MMP、DCFH-DA探针法检测ROS含量、萤火虫荧光素酶发光法测定ATP水平;利用透射电子显微镜观察线粒体超微结构及被包裹的线粒体数量、Mito-Tracker Red探针标记后利用激光共聚焦显微镜观察线粒体网状结构、Mito-Tracker Red和Lyso-Tracker Green探针共标记后利用激光共聚焦显微镜观察线粒体与溶酶体共定位水平;采用QRT-PCR法和蛋白免疫印迹法检测线粒体自噬相关基因表达量、线粒体自噬相关蛋白和Cleaved caspase-3蛋白表达量;DAPI染色后利用激光共聚焦显微镜观察细胞核形态学变化、利用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,与单独染镉组相比,葛根素与镉共处理组细胞活力显著升高(P<0.05)、线粒体膜电位明显恢复(P<0.05)、ROS含量显著降低(P<0.05)、ATP水平显著上升(P<0.05);线粒体网状结构和超微结构损伤缓解,被包裹线粒体数量显著减少,线粒体与溶酶体共定位水平降低;DRP1、PINK1、Parkin基因和蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01);细胞核形态趋于规则、Cleaved caspase-3蛋白表达水平和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05或P<0.01)。以上结果说明,葛根素通过抑制线粒体自噬阻断镉导致的rPT细胞凋亡。