鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的人兽共患烈性传染病,历史上已经有数以亿计的人被鼠疫夺走了生命。免疫接种是预防鼠疫的重要措施之一,但目前的鼠疫疫苗都存在各自的问题：灭活疫苗生产安全性差,保护效率低,有效期短,副反应率高,对肺鼠疫保护效果不佳：减毒鼠疫活菌苗,皮下注射对腺鼠疫保护效果好,但不良反应较大,有潜在毒性,对肺鼠疫不能完全保护,免疫效果不确定；重组亚单位疫苗能够克服传统疫苗的许多缺陷,不含有感染性组分,无致病性,而且对腺鼠疫和肺鼠疫均具有一定的免疫保护作用,但目前单纯亚单位疫苗免疫效果仍不理想。由可生物降解材料制成的微球是疫苗的良好载体,同时也是一种佐剂,但通常在微球制备过程中,疫苗要经受高机械剪切力和有机溶剂的考验,容易失去活性,因此在获得疫苗微球的过程中如何保持疫苗活性便成了关键问题。本文旨在研究一种可以避免传统微球缺陷并保留其优势的以多孔微球为载体并具有佐剂效应的鼠疫亚单位疫苗新型给药系统,提高其肌肉注射和鼻黏膜给药后的免疫效果。首先以生物可降解材料聚乳酸—羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体,分别以氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠为致孔剂,采用乳化溶剂挥发法来制备多孔微球,以光学显微镜和扫描电镜考察了微球形态学特征和粒径大小。结果表明,三种致孔剂中,碳酸钠的致孔效果最好,碳酸氢钠次之,氯化钠最差。其次,选择碳酸氢钠和碳酸钠作为致孔剂,设计单因素多水平实验考察了多种处方和工艺因素对所制得多孔微球孔隙率的影响,结果表明：随着内水相中致孔剂浓度的上升,微球孔隙率增大；固化过程中加入盐酸的量越多,孔隙率越低；随着加入盐酸时间的推移,微球孔隙率增高；不同处方和工艺因素对碳酸氢钠和碳酸钠作为致孔剂所制得多孔微球的影响相似,但以碳酸钠作为致孔剂所制得的多孔微球均匀性更好,孔隙率更大。在此基础上,确定以碳酸钠作致孔剂,以牛血清白蛋白(BSA)为模型药物,采用L18(37)正交设计实验考察了影响微球粒径、包封率和载药量的处方工艺因素。统计分析结果显示,微球粒径分布较均匀,孔隙率较高,但吸附载药量较低。其中显著影响微球粒径的处方工艺因素为：内水相中致孔剂的浓度和固化过程中加入盐酸的量。致孔剂浓度增大,微球粒径增大；固化过程中加入盐酸的量增加,微球粒径减小。显著影响微球孔隙率和吸附载药量的因素为内水相中致孔剂的浓度、固化过程中加入盐酸的量以及加入盐酸的时间：致孔剂浓度增大,微球孔隙率和吸附载药量都上升;固化过程中加入盐酸的量增加,微球孔隙率和载药量下降；加入盐酸时间越靠后,微球孔隙率和载药量上升。为了验证多孔微球载疫苗后免疫的效果,以鼠疫F1抗原和V抗原疫苗为目标药物,采用上述优化处方工艺条件所制得的多孔微球,通过孵育法将鼠疫亚单位疫苗吸附于多孔微球之上,制成鼠疫亚单位疫苗的多孔微球给药系统。鼠疫F1抗原和V抗原疫苗微球的载药量分别是115μg/mg和74μg/mg。以雌性BALB/c小鼠为动物模型,以载鼠疫疫苗多孔微球组为实验组,以单纯抗原组和单纯微球组为对照组,采用肌肉注射给药方式考察了不同实验组的免疫保护效果：通过ELISA法测定小鼠抗体滴度,通过攻毒实验考察小鼠存活率。结果显示：采用肌注方式给药,载鼠疫F1抗原的多孔微球和载鼠疫V抗原的多孔微球均显示了良好的免疫保护效果,两个实验组的抗体滴度均比单纯抗原或单纯微球的对照组相应的抗体滴度显著要高(P<0.05),攻毒实验实验组小鼠的存活率也显著高于单纯抗原或单纯微球的对照组(P<0.01)。最后我们进行了载鼠疫亚单位疫苗多孔微球的鼻黏膜给药免疫学评价,考察鼻黏膜给药与肌肉注射给药对鼠疫疫苗免疫学效果的影响,设计了不同的给药途径和给药剂量组。初步结果显示,目前所制鼠疫疫苗多孔微球鼻黏膜免疫效果相对于肌肉注射的免疫效果要差。这可能因为微球在小鼠鼻腔清除速率过快,从而导致疫苗尚未达到起效时间便被清除,因而不能引起足够的免疫应答。综上所述,本文以生物可降解材料PLGA为载体,采用乳化溶剂挥发法,通过在内水相中加入碳酸钠为致孔剂,制备获得了多孔微球,该多孔微球孵育后可以吸附鼠疫F1抗原和V抗原的亚单位疫苗,经注射给药获得了比单纯抗原或单纯微球更好的免疫保护效果。上述结果提示,本研究所获得的以PLGA为载体的载鼠疫亚单位疫苗多孔微球,能够提高疫苗本身的免疫效果,可能成为预防鼠疫的一种新型疫苗给药系统。